Para iniciar a quantificação das métricas de gotículas lipídicas IMAT coradas, abra Confocal Stacks no ImageJ. Abra a Interface do Usuário de Limite selecionando Imagem, Ajustar e Limite. Na interface do usuário, selecione Intermodos como o tipo de limite e verifique se Plano de fundo escuro está selecionado.
Em seguida, clique em Aplicar para executar um algoritmo de limite. Execute o algoritmo da bacia hidrográfica para separar as gotículas lipídicas em contato selecionando Processo, Binário e Bacia hidrográfica. Selecione Sim em uma caixa de diálogo para processar todas as imagens na pilha para adicionar uma linha preta fina dividindo áreas maiores de branco sólido.
Para definir os tamanhos máximo e mínimo de partículas, abra a imagem original e contorne a menor e a maior gota lipídica em exibição usando a ferramenta Oval. Em seguida, adicione essas formas ao ROI Manager digitando T.Select Analyze, depois Set Measurements. Na caixa de diálogo, selecione as configurações, marque Somente área e clique em OK. Em seguida, selecione Medir no Gerenciador de ROI.
Use as duas medidas de área desta janela de resultados como o intervalo de tamanho e analise as partículas. Identificar a região de interesse, ou ROIs, com o algoritmo analyze cells. Selecione Analisar e, em seguida, Analisar partículas.
Uma caixa de diálogo é aberta para definir as configurações de seleção. Para gerar as Medições de ROI, selecione Analisar, Definir Medidas e selecione Área, Centroide, Elipse de ajuste e Posição da pilha. Clique em OK. Em seguida, selecione Medir no Gerenciador de ROI.
Os dados na tabela de resultados podem ser selecionados e copiados para o Excel para análise posterior. Para uma avaliação detalhada das métricas e distribuição das gotículas lipídicas individuais, as gotículas lipídicas fluorescentemente marcadas com BODIPY foram imageadas por microscopia confocal. O limiar e a segmentação da forma forneceram uma boa primeira passagem para gerar ROIs para cada gota lipídica.
No entanto, foram necessárias edições manuais para corrigir os erros. Gotículas lipídicas profundas, que apareceram fracas na imagem, podem ser adicionadas manualmente usando a ferramenta Oval no ImageJ. Um grupo de gotículas lipídicas erroneamente identificadas como uma única ROI também pode ser corrigida excluindo e substituindo a ROI original por várias novas ROIs.
Quando uma única gota lipídica foi identificada como uma única ROI em múltiplos cortes, as ROIs duplicadas foram consolidadas em uma única ROI.
