Depois de clonar o peptídeo nucleador da vesícula, ou etiqueta de sequência VNP, no terminal amino da proteína de fusão, cultive um caldo de lisogenia de cinco mililitros, ou iniciadores LB, de transformações bacterianas frescas a 37 graus Celsius até a saturação. Em seguida, use-o para inocular 25 mililitros de caldo fantástico, ou TB, contendo seleção apropriada de antibióticos em um frasco cônico de 500 mililitros. Incubar o balão numa incubadora a 37 graus Celsius enquanto agita a 200 rotações por minuto ou superior a um lance orbital de 25 milímetros até que a cultura atinja um valor de densidade óptica de 600 nanómetros, ou OD 600, de 0,8 a 1,0.
Em seguida, induzir a expressão de proteínas recombinantes do promotor T7 adicionando IPTG a uma concentração final de até 20 microgramas por mililitro ou 84 micromolares. Depois de dar tempo suficiente para a indução, peletize as células por centrifugação a 3000 G a 4 graus Celsius por 20 minutos. Passe o sobrenadante através de um filtro de PES de 0,45 mícron estéril e sem detergente para esterilizar o meio que contém a vesícula para armazenamento a longo prazo.
Para concentrar as vesículas em um volume menor, passe a vesícula estéril contendo o meio através de um filtro MCE de 0,1 mícron estéril e livre de detergente. Em seguida, lave suavemente a membrana com 0,5 a 1 mililitros de solução salina estéril tamponada com fosfato, ou PBS, e use um raspador de células ou espalhador de plástico para remover cuidadosamente as vesículas da membrana. Transfira o concentrado da vesícula para um tubo de microcentrífuga fresco usando uma pipeta.
As vesículas purificadas podem ser armazenadas a quatro graus Celsius. Sonicar a proteína contendo vesículas no meio estéril usando um cronograma apropriado para romper as membranas lipídicas vesiculares e liberar proteína. Centrifugar a suspensão sonicada a 39.000 G e 4 graus Celsius durante 20 minutos para remover os detritos vesiculares.
BL21DE3 Escherichia coli contendo a construção de expressão VNp6-mNeongreen exibiu fluorescência mNeongreen sendo induzida durante a noite com IPTG. A fluorescência permaneceu visível na cultura após a remoção das células bacterianas por centrifugação. A presença de VNp-mNeongreen dentro da cultura em meios de cultura limpos foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio.
As vesículas purificadas ressuspensas em PBS também apresentaram fluorescência.
