Para corar a membrana da vesícula, adicione o corante lipídico fluorescente FM4-64 às vesículas purificadas em uma concentração final de dois micromolares e incube por 10 minutos antes da aquisição de imagens. Depois de isolar as vesículas cheias de proteína da cultura de Escherichia coli, pipetar as vesículas purificadas em uma almofada circular de agarose 2% LB de menos de um milímetro de espessura que foi deixada formar e colocada em uma lâmina de vidro limpa. Depois que o líquido secar, coloque uma tampa de 50 milímetros por 25 milímetros sobre as vesículas na almofada.
Segure a tampa no lugar com espaçadores e fita adesiva. Em seguida, monte a lâmina em um microscópio invertido usando uma objetiva de imersão em óleo e deixe a amostra por dois a três minutos para assentar e a temperatura se equilibrar. Para imagens de quadro único, use a média de três imagens para reduzir o ruído de fundo aleatório dependente do hardware.
Para imagens de lapso de tempo, aguarde de três a cinco minutos entre quadros individuais. A microscopia de fluorescência de campo largo mostrou vesículas purificadas contendo verde âmnio. O corante lipofílico fluorescente, FM4-64, confirmou a presença de membranas vesiculares.
A microscopia de iluminação estruturada das células bacterianas vivas expressando a proteína da membrana interna, CydB, fusionada ao verde âmnio, e VNp6-mCherry2 mostrou produção de vesículas e inserção de carga.
