Os autores agradecem a diversos usuários do Twitter que levantaram questões sobre o protocolo apresentado no artigo que descreve a tecnologia VNp. A Figura 1A foi gerada usando ícones de flaticon.com. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Kent e financiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BB/T008/768/1 e BB/S005544/1).

O trabalho bacteriano realizado segue as regulamentações locais, nacionais e internacionais de contenção de biossegurança adequadas ao nível de risco de biossegurança particular de cada cepa.
1. Seleção de diferentes VNps
<ol><li>Identifique as sequências VNp. NOTA: Para o presente estudo, foram identificadas três sequências de VNp1 que resultam em rendimento máximo e exportação vesicular das proteínas examinadas até o momento: VNp2, VNp6 e VNp15. Atualmente, não está claro por que certas variantes do VNp funcionam de forma mais eficiente com algumas proteínas do que outras; portanto, recomenda-se que sejam geradas fusões entre uma nova proteína de interesse com cada variante do VNp (i.e., VNp2, 6 ou 15). VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE Plasmídeos que permitem a expressão da proteína de interesse com diferentes fusões de VNp amino terminais foram disponibilizados comercialmente (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Projetar uma estratégia de clonagem para inserir o gene de interesse na extremidade 3' do cDNA que codifica para o VNp em uma dessas construções, ou adaptar um plasmídeo existente integrando o cDNA de VNp sintetizado a montante do primeiro códon ATG do gene que codifica para a proteína de interesse. Use os métodos descritos em1.</li>
	<li>Para proteínas tóxicas, use um vetor com um promotor de expressão repressível ou um promotor com mínimo ruído de expressão não induzido.</li>
	<li>Clone o tag de sequência VNp no amino-terminal da proteína de fusão. Certifique-se de que as etiquetas de afinidade, sequências de clivagem de protease, etc., e a proteína de interesse estejam localizadas no lado carboxila da etiqueta VNp. Recomenda-se separar o VNp do peptídeo a jusante com uma região ligante flexível, como duas ou três repetições de uma sequência polipeptídica -G-G-S-G- (Figura 1). NOTA: Use plasmídeos com uma seleção de antibióticos que não tem como alvo o peptidoglicano, o que enfraquece a superfície celular e reduz o rendimento da vesícula. Kanamicina e cloranfenicol (ver Tabela de Materiais) foram os antibióticos preferidos utilizados para este estudo.</li>
</ol>2. Cultura de células bacterianas e indução de proteínas
NOTA: As estirpes bacterianas normalmente utilizadas neste protocolo são Escherichia coli BL21 (DE3) ou W3110. As células de E. coli são cultivadas em caldo lisogênico (LB) (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L extrato de levedura) ou caldo fantástico (TB) (12 g/L triptona; 24 g/L extrato de levedura; 4 mL/L 10% glicerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, sais autoclavados separadamente) (ver Tabela de Materiais). Imagens de exemplo mostrando cada etapa da indução da proteína e subsequente processo de isolamento e purificação são mostradas na Figura 2.
<ol><li>Cultivar 5 mL de LB a partir de transformações bacterianas frescas a 37 °C até a saturação e utilizá-los para inocular 25 mL de TB em um frasco cônico de 500 mL, todos com seleção adequada de antibióticos.</li>
	<li>A relação superfície:volume é um fator importante na otimização deste sistema. Utilizar um frasco de volume tão grande quanto possível (por exemplo, frasco de 5 L contendo 1 L de cultura; para ensaios de otimização, utilizar 25 ml de meio num frasco de 500 ml).</li>
	<li>Incubar as culturas de frascos de agitação maiores numa estufa a 37 °C com agitação a 200 rpm (lançamento orbital de ≥25 mm) até atingir um valor de densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,8-1,0. NOTA: A vesiculação é ideal quando as células são cultivadas a 37 °C. Entretanto, algumas proteínas recombinantes requerem expressão em temperaturas mais baixas. Se este for o caso da proteína de interesse, o tag VNp6 deve ser usado, pois isso permite a exportação de vesículas de alto rendimento em temperaturas de até 25 °C.</li>
	<li>Para induzir a expressão de proteínas recombinantes do promotor T7, adicionar isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de até 20 μg/mL (84 μM) (ver Tabela de Materiais). A indução da expressão de proteínas recombinantes deve ocorrer na fase logarítmica tardia (isto é, OD600 típica de 0,8-1,0) para a produção de vesículas. NOTA: A duração do período de indução pode diferir entre as proteínas, com algumas atingindo a produção máxima em 4 h e outras durante a noite (18 h). Até à data, a exportação máxima de vesículas foi obtida em culturas nocturnas.</li>
</ol>3. Isolamento de vesículas recombinantes
<ol><li>Pellet as células por centrifugação a 3.000 x g (4 °C) por 20 min.</li>
	<li>Para esterilizar meios contendo vesículas para armazenamento a longo prazo, passe o meio de cultura limpo através de um filtro de polietersulfona (PES) 0,45 μm estéril e sem detergente (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para testar a exclusão de células viáveis do filtrado contendo vesículas, colocar placa em ágar LB e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
	<li>Para concentrar as vesículas em um volume menor, passe o meio estéril contendo vesículas através de um filtro estéril e livre de detergente de 0,1 μm de ésteres mistos de celulose (MCE) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Lave suavemente a membrana com 0,5-1 mL de PBS estéril usando um raspador de células ou espalhador de plástico para remover cuidadosamente as vesículas da membrana. Transfira para um tubo de microfuga fresco. NOTA: As vesículas purificadas podem ser armazenadas em meio estéril ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. Existem exemplos de proteínas recombinantes armazenadas nessas vesículas por 6 meses, desta forma, sem perda da atividade enzimática.</li>
</ol>4. Liberação de proteínas solúveis de vesículas isoladas
<ol><li>Uma vez que as vesículas contendo proteínas tenham sido isoladas no meio/tampão estéril, submeter as membranas lipídicas vesiculares à sonicação usando um esquema apropriado para o aparelho (por exemplo, ciclos de ligação e desativação de 6x 20 s) e centrifugação a 39.000 x g (4 °C) por 20 minutos para remover detritos vesiculares. NOTA: O choque osmótico ou o tratamento com detergente podem ser usados como uma alternativa para quebrar as vesículas, mas deve-se considerar o impacto sobre a funcionalidade da proteína e/ou a aplicação a jusante.</li>
	<li>Se a fusão de VNp permanecer citosólica e não for liberada no meio, isole a proteína usando protocolos padrão (por exemplo, ressuspender os pellets de células em 5 mL de um tampão de extração apropriado (tris 20 mM, NaCl 500 mM), sonicar e remover os restos celulares por centrifugação).</li>
</ol>5. Determinação da concentração de proteínas
<ol><li>Determinar a concentração de proteínas por análise de densitometria em gel de amostras triplicadas1. Executar juntamente com os padrões de carregamento de albumina de soro bovino (BSA) em géis de eletroforese em gel de poliacrilamida de poliacrilamida corados com coomassie (SDS-PAGE). Digitalize e analise os géis usando o software apropriado (por exemplo, Imagem J; ver Tabela de Materiais).</li>
</ol>6. Visualização da formação de vesículas e vesículas isoladas por microscopia de fluorescência
NOTA: Se as células contiverem marcadores de fusão ou membrana de VNp marcados fluorescentemente, a imagem de células vivas pode ser usada para acompanhar a formação de vesículas. Alternativamente, corantes lipídicos fluorescentes podem ser usados para visualizar vesículas para confirmar a produção e purificação.
<ol><li>Montagem de células<ol><li>Induza a expressão de fusão de VNp por várias horas antes de montar na lamínula.</li>
		<li>Método da almofada de agarose (Figura 3A-C): pipetar as células para uma almofada LB-agarose circular fina (<1 mm) que foi deixada formar e colocada em uma lâmina de vidro limpa. Deixe as células se acomodarem e se equilibrarem e coloque uma tampa de 50 mm x 25 mm sobre a almofada e as células. Segure a tampa no lugar com espaçadores e fita adesiva.</li>
		<li>Método da polietilenoimina (PEI) (Figura 3D-F): espalhe 20 μL de PEI a 0,05% (em dH2O) sobre uma lamínula com ponta de pipeta e deixe por 3-5 min para se prender ao vidro sem deixar secar. Adicionar 50 μL de cultura celular e deixar por 5-10 min para garantir que as bactérias tenham se associado à superfície revestida com PEI4. Lave a tampa com 100 μL de meio antes de colocá-la na lâmina e segure-a no lugar com espaçadores e fita adesiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem de vesículas<ol><li>Pipetar vesículas purificadas sobre uma almofada LB-agarose circular fina (<1 mm) que foi deixada formar e colocada em uma lâmina de vidro limpa. Depois de secar, coloque uma tampa de 50 mm x 25 mm sobre a almofada e as vesículas. Segure a tampa no lugar com espaçadores e fita adesiva.</li>
		<li>O corante lipídico fluorescente FM4-64 é capaz de corar membranas5 e, portanto, pode ser usado para visualizar vesículas. Adicionar FM4-64 (ver Tabela de Materiais) às vesículas purificadas a uma concentração final de 2 μM (a partir de um estoque de 2 mM dissolvido em dimetilsulfóxido [DMSO]) e imagem após uma incubação de 10 min. Isso é especialmente útil para identificar vesículas contendo cargas marcadas sem fluorescência5.</li>
		<li>Enxaguar as lamínulas com o mesmo meio utilizado para cultivar as células observadas. NOTA: Alguns meios complexos (por exemplo, TB) podem apresentar autofluorescência, o que pode resultar em excesso de sinal de fundo.</li>
	</ol></li>
	<li>Vesículas de imagem NOTA: Exemplos de imagens de microscopia de vesículas recombinantes de VNp podem ser vistos na Figura 4.<ol><li>Monte a lâmina em um microscópio invertido (veja Tabela de Materiais) usando uma objetiva de imersão em óleo e deixe por 2-3 min para permitir que a amostra se estabeleça e a temperatura se equilibre. NOTA: Todas as imagens de células vivas para cada amostra devem ser concluídas dentro de 30 minutos após a montagem das células em lamínulas para minimizar o impacto da fototoxicidade e do estresse anaeróbio. Por essa razão, as imagens de plano único são preferidas às pilhas z.</li>
		<li>Utilizar fontes de luz apropriadas (por exemplo, diodo emissor de luz [LED] ou lâmpada halógena; ver Tabela de Materiais) e combinações de filtros para a(s) proteína(s)/corante(s) fluorescente(s) utilizado(s)6.</li>
		<li>Use uma lente de alta ampliação (i.e., 100x ou 150x) e alta abertura numérica (i.e., NA ≥1.4) para obter imagens das células microbianas e vesículas.</li>
		<li>Determine a intensidade luminosa mínima necessária para visualizar sinais de fluorescência de células e/ou vesículas. Isso pode exigir algum ajuste das configurações de exposição e ganho para a câmera em uso. NOTA: Os tempos de exposição típicos das atuais câmeras CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) variam entre 50-200 ms, dependendo do sistema de imagem.</li>
		<li>Para imagens de quadro único, use a média de três imagens para reduzir o ruído de fundo aleatório dependente do hardware.</li>
		<li>Para imagens de lapso de tempo, aguarde de 3 a 5 minutos entre quadros individuais. NOTA: Dependendo da configuração do microscópio, o foco pode precisar ser ajustado intermitentemente ao longo de experimentos de lapso de tempo mais longos.</li>
	</ol></li>
</ol>

Produção e imagem de vesículas cheias de proteínas recombinantes de E. coli

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

O método marcado com peptídeo amino-terminal para a produção de proteínas recombinantes descrito acima é um processo simples, que consistentemente produz grandes quantidades de proteína que podem ser eficientemente isoladas e/ou armazenadas por meses.
É importante destacar as principais etapas do protocolo que são necessárias para o uso ideal desse sistema. Em primeiro lugar, a etiqueta VNp1 deve estar localizada no terminal N, seguida da proteína de interesse e das etiquetas apropriadas. Também é importante evitar o uso de antibióticos que têm como alvo a camada peptidoglicana, como a ampicilina.
Em termos de condições de crescimento, meios ricos (por exemplo, meios LB ou TB) e uma alta relação área:volume são necessários para maximizar a produção de vesículas. A temperatura ótima para a produção de vesículas extracelulares é de 37 °C, mas as condições tipicamente necessárias para a expressão da proteína de interesse também devem ser consideradas. Para temperaturas de indução mais baixas, deve-se usar VNp6. Crucialmente, a indução do promotor T7 deve ser obtida usando não mais do que 20 μg/mL (84 μM) de IPTG quando as células atingirem um OD600 de 0,8-1,0. As proteínas expressas usando o sistema atingem a produção máxima de vesículas em 4 h ou após a indução noturna.
Apesar da simplicidade deste protocolo, ele requer otimização. A fusão da variante VNp, as temperaturas de expressão e os períodos de tempo de indução podem diferir dependendo da proteína de interesse. Além disso, há necessidade de otimizar a purificação e subsequente concentração de vesículas extracelulares do meio. O procedimento atual não é escalável e pode ser demorado. Essas são as limitações dessa metodologia.
A tecnologia VNp apresenta muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais2. Permite a exportação vesicular de diversas proteínas, sendo o tamanho máximo expresso com sucesso até o momento de 175 kDa para vesículas que permanecem internas e 85 kDa para as que são exportadas. Além disso, essa tecnologia pode aumentar significativamente o rendimento de proteínas recombinantes com uma variedade de propriedades físicas e atividades. As vesículas exportadas contendo a proteína de interesse podem ser isoladas por filtração simples do meio pré-desembaraçado e podem ser posteriormente armazenadas, em meio de cultura estéril ou tamponamento, a 4 °C por vários meses.
As aplicações desse sistema são diversas, desde a ciência da descoberta até a biotecnologia aplicada e a medicina (por exemplo, através da produção de terapêuticas funcionais)3. A facilidade de produção, o processamento a jusante e o alto rendimento são qualidades atraentes nessas áreas e, especialmente, na indústria.

A bactéria Gram-negativa E. coli é um sistema atrativo para a produção de proteínas recombinantes em escala industrial e acadêmica. Não é apenas custo-efetivo e simples o cultivo em lotes de altas densidades, mas um amplo espectro de reagentes, cepas, ferramentas e promotores foram estabelecidos para promover a geração de proteínas funcionais em E. coli1. Além disso, técnicas de biologia sintética estão superando obstáculos tipicamente relacionados à aplicação de modificações pós-traducionais e enovelamento de proteínascomplexas2. A capacidade de direcionar a secreção de proteínas recombinantes em meios de cultura é atraente para melhorar o rendimento e reduzir os custos de fabricação. O empacotamento controlado de proteínas definidas pelo usuário em vesículas de membrana auxilia o desenvolvimento de produtos e tecnologias dentro das indústrias de biotecnologia aplicada e médica. Até o momento, faltavam métodos amplamente aplicáveis para a secreção de proteínas recombinantes de E. coli 3.
Eastwood e col. desenvolveram recentemente um método baseado em marcação de peptídeos para produzir e isolar vesículas contendo proteínas recombinantes de E. coli1. Este peptídeo nucleante de vesícula (VNp) permite a produção de vesículas de membrana bacteriana extracelular, nas quais a proteína recombinante de escolha pode ser direcionada para simplificar a purificação e o armazenamento da proteína-alvo, e permite rendimentos significativamente mais altos do que o normalmente permitido a partir de culturas de frascos agitados. Foram relatados rendimentos de cerca de 3 g de proteína recombinante por litro de cultura em frasco, com rendimentos >100x maiores do que aqueles obtidos com proteínas equivalentes sem a etiqueta VNp. Essas vesículas recombinantes enriquecidas com proteínas podem ser rapidamente purificadas e concentradas a partir do meio de cultura e fornecer um ambiente estável para armazenamento. Esta tecnologia representa um grande avanço na produção de proteína recombinante de E. coli. As vesículas compartimentalizam proteínas tóxicas e contendo ligação dissulfeto em uma forma solúvel e funcional, e suportam a purificação simples, eficiente e rápida de proteínas funcionais embaladas com vesículas para armazenamento de longo prazo ou processamento direto1.
As principais vantagens que essa tecnologia apresenta sobre as técnicas atuais são: (1) a aplicabilidade a uma variedade de tamanhos (1 kDa a >100 kDa) e tipos de proteínas; (2) facilitar a formação de ligações dissulfeto inter e intraproteínas; (3) aplicável a complexos multiproteicos; (4) pode ser usado com uma variedade de promotores e cepas padrão de E. coli de laboratório; (5) a geração de rendimentos de proteínas a partir de frascos agitados normalmente observados apenas em culturas de fermentação; as proteínas são exportadas e embaladas em vesículas ligadas à membrana que (6) fornecem um ambiente estável para o armazenamento da proteína solúvel ativa; e (7) simplifica o processamento a jusante e a purificação de proteínas. Esta ferramenta de proteína recombinante simples e econômica provavelmente terá um impacto positivo nas indústrias de biotecnologia e médica, bem como na ciência da descoberta.
Aqui, um protocolo detalhado, desenvolvido ao longo de vários anos, descreve as condições ideais para produzir vesículas cheias de proteínas recombinantes a partir de bactérias com a tecnologia VNp. Imagens de exemplo desse sistema na prática são mostradas, com uma proteína fluorescente sendo expressa, permitindo a visualização da presença de vesículas durante diferentes etapas de produção, purificação e concentração. Finalmente, são fornecidas orientações sobre como usar imagens de células vivas para validar a produção de vesículas contendo fusão de VNp a partir das bactérias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

Este sistema inovador, usando uma etiqueta peptídica curta, que exporta múltiplas proteínas recombinantes em vesículas ligadas à membrana de E. coli, fornece uma solução eficaz para uma série de problemas associados à expressão de proteínas recombinantes bacterianas. Essas vesículas recombinantes compartimentam proteínas dentro de um microambiente que facilita a produção de proteínas de bactérias que de outra forma desafiam, tóxicas, insolúveis ou contendo ligações de dissulfeto. O rendimento proteico é aumentado consideravelmente quando comparado à expressão bacteriana típica na ausência da etiqueta peptídica nucleante da vesícula. A liberação de proteínas embaladas na vesícula suporta o isolamento do meio de cultura e permite o armazenamento de proteína ativa a longo prazo. Esta tecnologia dá origem ao aumento dos rendimentos de proteínas funcionais embaladas com vesículas para processamento simplificado a jusante para uma gama diversificada de aplicações, desde biotecnologia aplicada até ciência e medicina de descobertas. No presente artigo e no vídeo associado, um protocolo detalhado do método é fornecido, destacando etapas fundamentais na metodologia para maximizar a produção de vesículas preenchidas por proteína recombinante.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

Autor em destaque: A produção de proteínas recombinantes 

Produção e análise otimizadas de vesículas cheias de proteína recombinante de E. coli

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli contendo o construto de expressão VNp6-mNeongreen foram cultivadas até a fase logarítmica tardia (Figura 2A). A expressão de VNp6-mNeongreen foi induzida pela adição de IPTG à cultura (concentração final de 20 μg/mL ou 84 μM), que foi posteriormente deixada para crescer durante a noite a 37 °C com agitação vigorosa (200 rpm, lançamento orbital de ≥25 mm). Na manhã seguinte, a cultura mostrou fluorescência7 mNeongreen (Figura 2B), que permaneceu visível na mídia após a remoção das células bacterianas por centrifugação (Figura 2C). A presença de VNp-mNeongreen no interior da cultura e dos meios de cultura limpos foi confirmada por SDS-PAGE (Figura 2D). As vesículas contendo mNeongreen foram isoladas em um filtro MCE de 0,1 μm (Figura 2E) e ressuspensas em PBS (Figura 2F). As vesículas purificadas foram posteriormente montadas em uma almofada de agarose (Figura 3A-C) e imageadas usando microscopia de fluorescência de campo largo (Figura 4A). A presença de membranas vesiculares foi confirmada pelo corante lipofílico fluorescente FM4-64 (Figura 4B). As células de E. coli que expressam a proteína CydB da membrana interna fusionada a mNeongreen (verde) e VNp6-mCherry2 (magenta)8 mostram produção de vesículas e inserção de carga em células bacterianas vivas (Figura 4C). As figuras 4A,B foram captadas em microscópio de fluorescência de campo largo, enquanto a Figura 4C foi adquirida em microscopia de iluminação estruturada (SIM), utilizando-se métodos descritosanteriormente9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> Figura 1: Resumo da tecnologia VNp desde a concepção de uma estratégia de clonagem até a purificação e armazenamento de vesículas extracelulares . (A) Esquema de uma proteína típica de fusão de VNp. VNp no terminal NH2, seguido por um ligante flexível e uma combinação apropriada de tags de afinidade e fluorescência (Tag1, Tag 2, local de clivagem de protease [por exemplo, TEV]) e proteína de interesse. (B) Diagrama esquemático resumindo o protocolo para a expressão e purificação de vesículas de membrana preenchidas por proteínas recombinantes de E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> Figura 2: Etapas de produção e purificação das vesículas VNp6-mNg. Culturas de células de E. coli contendo a expressão de VNp-mNeongreen foram construídas em luz azul antes (A) ou após (B) expressão induzida por IPTG da proteína de fusão. As células de (B) foram removidas por centrifugação, deixando vesículas preenchidas com VNp-mNeongreen no meio (C). (D) Amostras equivalentes de A, B e C foram analisadas por SDS-PAGE e coloração de coomassie. As vesículas foram isoladas em um filtro de 0,1 μm (E) e posteriormente lavadas em um volume apropriado de tampão (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> Figura 3: Procedimento de montagem celular para obtenção de imagens de vesículas e produção de vesículas. (A-C) O método da almofada de agarose e (D-F) o método PEI para a montagem de células de E. coli na lamínula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> Figura 4: Imagens microscópicas de vesículas recombinantes de VNp. Imagens de emissão verde (A) e vermelha (B) de diferentes campos de vesículas contendo FM4-64 marcadas com VNp6-mNeongreen montadas em uma almofada de agarose. (C) Imagens de células de E. coli expressando a proteína de membrana interna CydB fusionada a mNeongreen (verde) e VNp6-mCherry2 (magenta) mostram a produção de vesículas e inserção de carga em células bacterianas vivas. (A,B) foram obtidas usando microscópio de fluorescência de campo largo, enquanto (C) foi adquirida usando microscopia de iluminação estruturada (SIM). Barras de escala: (A,B) = 10 μm; (C) = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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O presente protocolo descreve um método detalhado para a produção bacteriana de proteínas recombinantes, incluindo proteínas tipicamente insolúveis ou contendo ligação dissulfeto, embaladas dentro de vesículas ligadas à membrana extracelular. Isso tem potencial para ser aplicado a áreas versáteis da pesquisa científica, incluindo biotecnologia aplicada e medicina.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

Estamos tentando entender as interações dinâmicas entre moléculas dentro de células vivas. Para a análise bioquímica, pode ser necessário o uso de grandes quantidades de proteína recombinante. Estes podem ser extremamente difíceis de expressar de forma corretamente dobrada e funcional.Se uma proteína fosse mal dobrada ou insolúvel quando expressa em bactérias, os pesquisadores teriam que recorrer a células de mamíferos, o que é caro e relativamente lento, ou usar polipeptídeos sintéticos. Nosso protocolo permite a expressão de alto rendimento, bem como a exportação de proteínas desafiadoras de E.coli. Adicionar uma curta sequência peptídica clivável ao terminal amino da proteína não só aumenta a produção e o rendimento de cada proteína que testamos até o momento, mas também exporta a proteína da célula para o meio.Além de simplificar a expressão de proteínas, também simplifica a purificação de proteínas a jusante.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K visualizações.  University of Kent. Estamos tentando entender as interações dinâmicas entre moléculas dentro de células vivas. Para a análise bioquímica, pode ser necessário o uso de grandes quantidades de proteína recombinante. Estes podem ser extremamente difíceis de expressar de forma corretamente dobrada e funcional.Se uma proteína fosse mal dobrada ou insolúvel quando expressa em bactérias, os pesquisadores teriam que recorrer a células de mamíferos, o que é caro e relativamente lento, ou usar polipe...

Vídeo: Autor em destaque: A produção de proteínas recombinantes 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Biologia

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

Isolamento de Vescículos Recombinantes de Cultura Bacteriana para Liberação de Proteína Solúvel

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.