Após estabelecer a co-cultura de células endoteliais estromais, adquira o sinal de GFP do huvec de GFP usando microscopia de fluorescência com ajustes adequados para quantificação. Pré-processe todas as imagens adquiridas no mesmo dia para melhorar ainda mais o contraste. Se estiver usando fiji ou imagem J, abra todas as imagens aprimoradas do canal GFP ao mesmo tempo, aponte e abra o menu de brilho e contraste.
Selecione uma imagem que represente uma condição intermediária e ajuste automaticamente o contraste selecionando automático. Clique em definir e marque propagar para todas as outras imagens abertas. Avalie visualmente se o intervalo selecionado automaticamente se ajusta a todas as imagens do ponto de tempo atual.
Se necessário, reajuste e repropague manualmente o intervalo para todas as imagens e salve as imagens ajustadas como arquivos TIFF. Em seguida, aplique um filtro de desfoque mediano a todas as imagens. Reduza o tamanho binning e salve-os como arquivos TIFF de cor RGB em escala de cinza em uma pasta para quantificação.
Isso pode ser feito manualmente ou em modo de lote usando macros. Analise todas as imagens criadas usando o modo de processo em lote no analisador de angiogênese para imagem J.Em seguida, valide os resultados da quantificação examinando as sobreposições das estruturas reconhecidas e as imagens originais. Ajuste os parâmetros de pré-processamento, reanalise as imagens originais ou exclua áreas problemáticas se o algoritmo detectar estruturas artificiais com poucas ou nenhuma célula visível na imagem original.
Finalmente, normalizar os valores obtidos para uma área de um milímetro quadrado, multiplicando os valores de cada amostra pela razão da área analisada para um milímetro quadrado. Os parâmetros quantificados das redes de fogueira mostraram que o comprimento total da rede foi maior na presença de FGF-2 e menor na ausência de fatores de crescimento. O número de junções indicadoras de pontos de ramificação nas redes seguiu a mesma tendência do comprimento total.
Por outro lado, ambos os fatores de crescimento apresentaram significativamente menos segmentos isolados, indicando maior interconectividade do que a condição sem qualquer fator de crescimento.
