Comece a resfriar um moedor de café comercial moendo aproximadamente 30 a 50 gramas de gelo seco duas vezes, por 30 segundos cada vez. Descarte o pó de gelo seco e misture três gramas de espaguete de célula de levedura congelado com aproximadamente 30 a 50 gramas de gelo seco no moedor de café pré-resfriado. Sele a junção entre a tampa e o moedor com Parafilm.
Misture a célula de levedura misturar gelo seco 10 vezes, por 30 segundos cada, permitindo intervalos de 30 segundos entre cada rodada. Transfira o pó de gelo seco da célula de levedura resultante para um copo de plástico, usando uma espátula limpa e seca. Após a evaporação do gelo seco, adicionar 2,25 mililitros de esferas magnéticas, ou tampão MB, com inibidores de protease e fosfatase, ao pó de células de levedura.
Depois de pipetar vigorosamente a mistura tampão celular, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, armazenar 0,1% de amostras dos extratos de células brutas para DNA e 0,05% de amostras para análise de proteínas, a menos 20 graus Celsius. Transfira a suspensão celular restante para tubos de reação de dois mililitros de baixa ligação e separe os restos celulares centrifugando os tubos.
Uma vez feito, puxe todos os sobrenadantes em um tubo cônico de 15 mililitros. Novamente, armazenar 0,1% do sobrenadante a menos 20 graus Celsius para o DNA, e 0,05% do sobrenadante para análise de proteínas. Em seguida, lavar 500 microlitros de pasta magnética acoplada à imunoglobulina G com 500 microlitros de tampão MB frio, contendo inibidores de protease e fosfatase, duas vezes, por cinco minutos cada, a quatro graus Celsius, em rotação a 20 RPM.
Incubar as esferas magnéticas em 500 microlitros de tampão MB frio por uma hora a quatro graus Celsius, em rotação a 20 RPM, antes de remover o sobrenadante das esferas usando um rack magnético. Misture a lama de esferas magnéticas equilibrada com o lisado celular obtido anteriormente e puxado para um tubo cônico de 15 mililitros. Depois de incubar por duas horas a quatro graus Celsius e 20 RPM, transfira a suspensão completa de lisado de células de esferas magnéticas para tubos de reação de baixa ligação.
Separe as esferas magnéticas que carregam os anéis de cromatina de interesse do lisado celular, usando um rack magnético. Transfira o fluxo restante de cada tubo para um novo tubo cônico de 15 mililitros, antes de armazenar algumas amostras a -20 graus Celsius negativos para análise de DNA e proteínas. Em seguida, suspenda o talão magnético de cada tubo cônico de 15 mililitros em 300 microlitros de tampão MB frio e combine as esferas em um tubo de reação.
Realizar cinco lavagens de 10 minutos cada, utilizando 750 microlitros de tampão MB frio, contendo inibidores de protease e fosfatase, a quatro graus Celsius, girando a 20 RPM. Em seguida, realizar a lavagem final com 750 microlitros de tampão MB frio sem inibidores de protease e fosfatase. Suspender as esferas preparadas em 40 microlitros de tampão MB frio sem inibidores de protease e fosfatase.
