Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Um núcleo eucariótico é muito povoado com muitos processos biológicos ocorrendo simultaneamente. O escopo de nossa pesquisa é entender como todos esses processos são coordenados em nossos genomas sem grandes acidentes que, de outra forma, levariam à instabilidade genômica e doenças humanas. Este protocolo permite purificar um locus específico do genoma em seu estado nativo, permitindo tanto a caracterização composicional quanto funcional do material isolado, como as medidas de interações de DNA proteico.

Este protocolo permite um enorme nível de enriquecimento de um locus alvo, que supera muitas limitações atuais do isolamento de cromatina locus-específico. O material não foi cruzado. Isso também permite muitas análises funcionais a jusante, como transcrição in vitro ou replicação in vitro.

Este protocolo nos permitiu excisar e purificar distintas origens de replicação de cromossomos de leveduras, permitindo-nos realizar uma análise proteômica e identificar novos fatores de cromatina interagindo de origem e, portanto, avançar no campo de pesquisa da replicação do DNA. Este protocolo permite estudos de replicação in vitro utilizando o material de origem purificada para examinar estados de cromatina, modificações de histonas e realizar análises estruturais em moldes nucleossômicos nativos de cromossomos endógenos, avançando na pesquisa da cromatina.