Libere os complexos de anéis de cromatina lexA CBP dos grânulos magnéticos usados para purificar o locus gênico de cópia única da cromatina incubando as abelhas com dois microlitros de vírus recombinante do tabaco etch marcado com 6xHis ou protease TEV. Depois de separar as abelhas do eluato final usando uma transferência magnética em rack, o eluato contendo anéis de cromatina clivados para um novo tubo de reação de 1,5 mililitro. Novamente, coloque os tubos em um rack magnético para separar as contas residuais do eluato final.
Ressuspenda as esferas em 750 microlitros de tampão de carbonato de amônio frio antes de armazenar algumas amostras a 20 graus Celsius para análise de DNA e proteínas. A partir do eluato final, retire as amostras e armazene-as a 20 graus Celsius para análise de DNA e proteínas. Além disso, retire amostras das contas residuais.
Comece a eluição da desnaturação lavando as esferas magnéticas duas vezes em 750 microlitros de tampão de carbonato de amônio frio por 20 minutos cada, quatro graus Celsius girando a 20 rotações por minuto. Em seguida, adicione 500 microlitros de hidróxido de amônio 0,5 molar às esferas para extrair complexos de cromatina lexA ligados e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Separe as esferas da suspensão usando um rack magnético e transfira o eluato para um tubo de reação de baixa ligação.
Incubar o tubo de baixa aderência à temperatura ambiente durante 30 minutos e separar as esferas da suspensão utilizando um rack magnético. Uma vez feito, transfira o eluato para um tubo de reação de baixa ligação. Ressuspender as contas em 750 microlitros de água deionizada e coletar amostras para análise de DNA e proteínas.
Por fim, obter amostras de análise de DNA e proteínas do eluato final. No estudo, a eficiência de purificação do locus ARS316 e da deformação de recombinação foi quantificada e comparada com o locus controle PDC1. O locus ARS316 apresentou menor recuperação no escoamento através do PDC1.
Embora uma fração dos anéis de cromatina tenha permanecido ligada às esferas do TEV devido à clivagem incompleta da protease do TEV, a eluição da desnaturação resultou na recuperação do locus ARS316 de 80 a 90%. Isso corresponde ao alto enriquecimento de moléculas ARS316 em esferas de TEV e frações de eluição de desnaturação quando se leva em consideração o tamanho do genoma da levedura em comparação com a cepa controle que não mostrou enriquecimento do locus ARS316 em nenhuma das frações quantificadas. Após a eluição do VET, as esferas apresentaram maior porcentagem de recuperação do locus ARS316, pois a eficiência de clivagem do TEV não foi de 100%, o que resultou em uma fração de anéis de cromatina permanecendo ligados às contas.
No entanto, a elusão desnaturante mostrou 80 a 90% de recuperação do locus ARS316 e a cepa de recombinação correspondendo ao alto enriquecimento das moléculas ARS316 quando se considerou o tamanho do genoma da levedura.
