Comece centrifugando a suspensão de células cerebrais isoladas a 300G por oito minutos. Ressuspender o pellet em 80 microlitros de HBSS com solução de BSA a 0,5%. Adicione 20 microlitros de coquetel de anticorpos de biotina de células não neuronais e incube.
Lavar as células com dois mililitros de HBSS com BSA a 0,5%. Em seguida, ressuspenda o pellet da centrífuga em 80 microlitros de HBSS com BSA 0,5%. Agora adicione 20 microlitros de microesferas anti biotina e pipeta para misturar completamente.
Após incubação a frio, adicionar 0,5 mililitros de solução de BSA HBSS. Montar o suporte antes de enxaguar a coluna com 0,5 mililitros de HBSS com 0,5% BSA. Em seguida, coloque um tubo de 15 mililitros sob a coluna e passe 0,5 mililitros da suspensão celular por ele.
Realizar três lavagens com 0,5 mililitros de HBSS com solução de BSA a 0,5% para capturar células neuronais residuais. Retire a coluna do ímã e coloque-a dentro de um novo tubo de 15 mililitros. Adicione um mililitro de HBSS com 0,5% de BSA e use o êmbolo para coletar células não neuronais marcadas magneticamente.
Após a centrifugação celular, ressuspendê-las em um mililitro de HBSS com solução de BSA a 0,5%. Conte as células em uma câmara de contagem de neubauer sob um microscópio de campo claro. Os neurônios LepR positivos começaram a formar neuritos após 48 horas.
Na DIV4 as extensões axonais mostraram progresso enquanto os processos dendríticos começaram a aparecer. Na DIV6 os neurônios estavam suficientemente desenvolvidos. Estudos de imunofluorescência mostraram que não foram observadas células gliais ou outras células não neuronais.
A natureza neuronal das células foi confirmada pela coloração da proteína dois associada aos microtúbulos. Na DIV10, 30% das células LepR positivas expressaram POMC. A conectividade sináptica e a funcionalidade foram observadas em culturas gerais contendo populações neuronais hipotalâmicas heterogêneas.
