Comece centrifugando a suspensão de células neuronais puras murinas a 300 G por oito minutos. Aspirar suavemente o sobrenadante e ressuspender o pellet em 80 microlitros de HBSS com solução de BSA 0,5. Depois de adicionar o anticorpo específico, incubar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Lave o excesso de anticorpos com solução de HBSS-BSA e centrífuga. Adicionar 20 microlitros de microesferas de antibiotina ao pellet, ressuspendido em HBSS-BSA. Incubar o tubo a quatro graus Celsius durante 10 minutos.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de HBSS com solução de BSA a 0,5% para cada 10 às sete células. Enxaguar a coluna com 0,5 mililitros de HBSS com solução de BSA a 0,5%. Quando o gotejamento parar, coloque um tubo de 15 mililitros sob a coluna e passe 0,5 mililitros de suspensão celular por ele.
Recolher o eluato contendo células neuronais inespecíficas e, em seguida, limpar a coluna com três lavagens de 0,5 mililitros de HBSS com BSA a 0,5%. Agora remova a coluna do ímã e coloque-a em um novo tubo de 15 mililitros. Adicione um mililitro de HBSS com 0,5% de BSA e use o êmbolo para eliminar as células-alvo.
Após centrifugação e aspiração do sobrenadante, ressuspender o pellet em 0,5 mililitros de meio de plaqueamento. Conte as células em uma câmara de contagem de Neubauer sob um microscópio de campo claro. Plaquear as células-alvo como controle positivo e as células não específicas como controle negativo na placa preparada de 24 poços.
Incubar a 37 graus Celsius por 12 horas. Os neurônios LepR-positivos começaram a formar neuritos após 48 horas. Na DIV4, as extensões axonais mostraram progresso, enquanto os processos dendríticos começaram a aparecer.
Na DIV6, os neurônios estavam suficientemente desenvolvidos. Estudos de imunofluorescência mostraram que não foram observadas células gliais ou outras células não neuronais. A natureza neuronal das células foi confirmada pela coloração da proteína 2 associada aos microtúbulos.
Na DIV10, 30% das células LepR-positivas expressaram POMC. Conectividade sináptica e funcionalidade foram observadas em culturas gerais contendo populações neuronais hipotálmicas heterogêneas.
