Ao trabalhar sob uma capela de fluxo laminar classe dois, comece lavando sequencialmente os tecidos adiposos perivasculares ou PVATs coletados de camundongos duas vezes. Primeiro, usando PBS contendo 10% de penicilina-estreptomicina e, em seguida, usando PBS suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina. Transfira os tecidos enxaguados para uma placa de Petri estéril de 60 milímetros e adicione 200 microlitros de solução de digestão a ela.
Usando tesouras estéreis, pice os tecidos em pedaços com uma dimensão de um milímetro cúbico. Com a ajuda de uma tesoura estéril, corte uma ponta de pipeta de plástico para ampliar sua extremidade. Em seguida, transfira a mistura de tecido picado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros usando a ponta da pipeta de extremidade larga.
Adicione seis mililitros da solução de digestão aos tecidos para iniciar a digestão. Depois de amarrar o tubo horizontalmente em um rack, incube-o a 37 graus Celsius em um agitador orbital por 30 a 45 minutos. A cada 5 a 10 minutos, retire o tubo do agitador na incubadora e agite-o manualmente para cima e para baixo vigorosamente.
Passe a mistura de tecido digerido através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Enxágue o filtro com um volume igual de meio de cultura para maximizar o rendimento celular e extinguir a digestão. Transfira o filtrado para um novo tubo centrífugo de 15 mililitros.
Centrifugar o tubo para isolar a fração vascular estromal ou FVS. Inverter o tubo para descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em cinco mililitros de PBS. Centrifugar o tubo novamente a 1.800 G por cinco minutos antes de descartar o sobrenadante.
Ressuspender o pellet em volume apropriado de meio de cultura. Seme as células em uma placa de 12 poços revestida de colágeno e incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera úmida com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova restos celulares e hemácias aspirando o meio de cultura e lavando as células com PBS pré-aquecido a 37 graus Celsius suplementado com antibiótico.
Finalmente, adicione um mililitro de meio de cultura fresco a cada poço e continue cultivando as células até que atinjam o estágio desejado de confluência.
