Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130012 e 81830010) e pelos projetos Nurture para pesquisa básica do Shanghai Chest Hospital (Número de Bolsa: 2022YNJCQ03).

Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.
1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura
<ol><li>Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a 75%.</li>
	<li>Preparar solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 1% v/v e mais 10 mL de PBS suplementado com penicilina-estreptomicina a 10% v/v. NOTA: Nas seções a seguir, se não for especificamente mencionado, PBS refere-se a PBS estéril regular.</li>
	<li>Preparar tampão Krebs Ringer HEPES BSA: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, HEPES 20 mM dissolvido em solução de Krebs Ringer.</li>
	<li>Preparar solução de digestão fresca: colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) dissolvida em tampão Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilizar a solução com um filtro de 0,2 μm.</li>
	<li>Prepare uma placa de 12 poços revestida de colágeno.<ol><li>Diluir a solução de colágeno (1 mg/mL) com água deionizada estéril até a concentração de 40 μg/mL. Adicionar 1 ml da solução de colagénio diluída na superfície de cada poço para atingir uma concentração de 6-10 μg/cm2. Incubar o revestimento durante 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire a solução restante e lave cada poço 2x com 1 mL de PBS. Use a placa imediatamente ou seque a placa ao ar em uma capela de fluxo laminar classe II e armazene a placa revestida a 2-8 °C. Ao armazenar, sele as placas revestidas com parafilme.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar meio de cultura: meio Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) com alto teor de glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% v/v penicilina-estreptomicina. Manter a 4 °C até 2 semanas.</li>
	<li>Preparar meio de indução lipogênico: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM, insulina 1 μM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (IBMX) e dexametasona 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.</li>
	<li>Preparar meio de manutenção: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM e insulina a 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.</li>
</ol>2. Dissecção e isolamento do tecido adiposo perivascular (PVAT)
<ol><li>Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia com isoflurano a 2% ou com overdose de dióxido de carbono. Borrifar com álcool 75% para desinfecção da pele.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito dorsal horizontal (virado para cima).</li>
	<li>Levante a pele, faça uma pequena incisão e separe sem rodeios a pele e os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço. Exponha o coração e os pulmões cortando o diafragma e as costelas ao longo de ambos os lados da linha média.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o fígado, baço, intestinos e rins. Evite cortar a parede intestinal.</li>
	<li>Remova os pulmões e o esôfago.</li>
	<li>Levante suavemente o coração com pinça em uma mão e separe a aorta da coluna vertebral com tesoura cirúrgica na outra mão. Em seguida, colocar o coração e a aorta em uma placa de Petri de 60 mm com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.</li>
	<li>Retire a pinça microcirúrgica e a tesoura microcirúrgica do álcool e enxágue em 25 mL de PBS para remover o excesso de álcool. Sob um microscópio estéreo, remova o timo e outros tecidos do coração e da aorta, em seguida, remova o coração, deixando a aorta com os PVATs.</li>
	<li>Transferir a aorta com os PVATs para uma placa de Petri limpa de 60 mm com PBS contendo 1% v/v de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Utilizar pinças microcirúrgicas para retirar os PVATs, com um par de pinças fixando a aorta e a outra arrancando o tecido adiposo. Remova o tecido da vasculatura tanto quanto possível, minimizando os danos ao tecido adiposo perivascular.</li>
	<li>Coletar o PVAT ao redor da aorta torácica no tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo DMEM com alto teor de glicose suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% v/v colocado sobre gelo.</li>
</ol>3. Isolamento da fração vascular estromal (FVS)
<ol><li>Enxaguar sequencialmente os tecidos coletados com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 10% v/v e PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v. NOTA: A partir desta etapa, todos os experimentos devem ser realizados em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar classe II.</li>
	<li>Transfira os tecidos para uma placa de Petri estéril de 60 mm, adicione 200 μL de solução de digestão e pique-os em pedaços de 1 mm3 usando tesoura estéril.</li>
	<li>Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma ponta de pipeta de plástico, a extremidade alargada por um corte de tesoura estéril, e adicione 6 mL de solução de digestão para iniciar a reação de digestão. NOTA: Uma reação de digestão (3 mL de solução de digestão) é suficiente para depósitos de PVAT de seis camundongos.</li>
	<li>Incubar os tecidos a 37 °C numa estufa com um agitador orbital (frequência de 150 rpm para uma mistura eficaz) durante 30-45 minutos. Amarre os tubos em um rack para fazer os tubos tremerem horizontalmente. Agite para cima e para baixo vigorosamente com a mão por 10 s a cada 5-10 min. NOTA: A digestão pode ser interrompida quando um fluido digestivo homogêneo e amarelado é visto sem fragmentos de tecido restantes.</li>
	<li>Coar os tecidos digeridos através de um filtro celular de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Enxaguar o filtro celular com um volume igual de meio de cultura para maximizar o rendimento celular e interromper a digestão.</li>
	<li>Transfira o filtrado para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 1.800 × g por 10 min. Inverter o tubo para descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets em 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda os pellets em volume apropriado de meio de cultura. NOTA: Os pellets celulares coletados de cada seis camundongos são ressuspensos em 1 mL de meio de cultura e semeados em um poço de uma placa de 12 poços.</li>
	<li>Semeando as células em uma placa de 12 poços revestida de colágeno e incubar a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, aspirar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido (37 °C) contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v para remover restos celulares e hemácias e adicionar de volta 1 mL de meio de cultura fresco em cada poço.</li>
</ol>4. Indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico
<ol><li>Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam ~60-70% de confluência. NOTA: Geralmente leva 3-4 dias para que as células atinjam 60-70% de confluência.</li>
	<li>Quando as células atingirem 60-70% de confluência, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por meio de indução adipogênico marrom. Considerar o dia de indução da diferenciação adipogênica como o dia 0 da diferenciação.</li>
	<li>Após 72 h (dia 3 de diferenciação), refrescar o meio com o meio de manutenção. Troque o meio de manutenção a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos.</li>
	<li>Analisar as células adipogênicas de forma adequada, como coloração Oil Red O14 e western blotting15.</li>
</ol>

Cultura de pré-adipócitos isolados de tecido adiposo perivascular murino

<ol>
	<li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system:+is+fat+always+bad.">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li><li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes.">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li><li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction.">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity.">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li><li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue.">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation.">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue.">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li><li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li><li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue:+preliminary+results.">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).</li><li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications.">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li><li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation.">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).</li><li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology.">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li><li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture.">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li><li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cort&#233;s, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice.">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue/endothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK/eNOS+pathway.">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li><li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling.">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li><li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats.">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li><li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling.">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).</li><li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte.">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li><li>Stanek, A., Bro&#380;yna-Tkaczyk, K., My&#347;li&#324;ski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+(PVAT)+dysfunction+in+vascular+homeostasis.">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).</li><li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).</li><li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation.">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-&#947;+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis.">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-&#947; deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li><li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm.">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II.">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).</li><li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease.">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li><li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation.">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li><li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fern&#225;ndez-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis.">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li><li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice.">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.

Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, po...

Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente1. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doençascardiovasculares2,3,4. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tronco adiposas e progenitoras (ASPCs)5,6. Sabe-se que as ASPCs residentes na FVS do tecido adiposo podem dar origem a adipócitos maduros5. Infere-se que a FVS seja uma fonte crítica de adipócitos maduros em PVAT. Vários estudos têm demonstrado que o PVAT-SVF pode se diferenciar em adipócitos maduros sob condições específicas de indução 6,7,8.
Atualmente, existem dois sistemas de isolamento para isolar a FSV do tecido adiposo, um é a digestão enzimática e o outro é o nãoenzimático9. Métodos enzimáticos tipicamente resultam em maior rendimento de células progenitoras nucleadas10. Até o momento, os benefícios da FVS em promover regeneração vascular e neovascularização na cicatrização de feridas, doenças urogenitais e cardiovasculares têm sido amplamente demonstrados11, especialmente na dermatologia e na cirurgiaplástica12,13. No entanto, as perspectivas de aplicação clínica da FV derivada do PVAT ainda não foram bem exploradas, o que pode ser atribuído à falta de um método padronizado para o isolamento da FVS do PVAT. O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA a partir de PVAT de camundongos ao redor da aorta torácica, permitindo uma investigação mais aprofundada da função da PVAT. Este protocolo otimiza técnicas de processamento tecidual e diferenciação celular para cultura de adipócitos periaórticos obtidos de camundongos jovens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m syringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate&#160;</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>11210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>310109003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-2877</td>
			<td>1 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Labselect</td>
			<td>CT-002-50A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-adiponectin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22554</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>CST</td>
			<td>4850</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FABP4</td>
			<td>CST</td>
			<td>2120</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PGC1&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab191838</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PPAR&#947;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-14889</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-UCP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10983</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;-Actinin</td>
			<td>CST</td>
			<td>6487</td>
			<td>1:1,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes</td>
			<td>Shanghai Model Organisms Center, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m, nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High glucose DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with orbital shaker</td>
			<td>Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd.</td>
			<td>LYZ-103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (cattle)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11070-73-8</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Ringer&#39;s Solution</td>
			<td>Pricella&#160;</td>
			<td>PB180347</td>
			<td>protect from light&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O&#160;</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>A600395-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd</td>
			<td>B548117-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td>1:5,000 working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td>1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard forceps</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue

O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.

Perivascular adipose tissue (PVAT), a perivascular structure composed of a mixture of mature adipocytes and a stromal vascular fraction (SVF), is believed to interact with the adjacent vessel wall via its secretome paracrineally1. As a critical regulator of vascular homeostasis, PVAT dysfunction is implicated in the pathogenesis of cardiovascular diseases2,3,4. The SVF of adipocyte tissue consists of several expected cell populations, including endothelial cells, immune cells, mesothelium cells, neuronal cells, and adipose stem and progenitor cells (ASPCs)5,6. It is well known that ASPCs residing in the SVF of adipose tissue can give rise to mature adipocytes5. SVF is inferred to be a critical source of mature adipocytes in PVAT. Several studies have shown that PVAT-SVF can differentiate into mature adipocytes under specific induction conditions6,7,8.
Currently, there are two isolation systems for isolating SVF from adipose tissue, one is enzymatic digestion and the other is non-enzymatic9. Enzymatic methods typically result in a higher yield of nucleated progenitor cells10. To date, the benefits of SVF in promoting vascular regeneration and neovascularization in wound healing, urogenital, and cardiovascular diseases have been widely demonstrated11, especially in dermatology and plastic surgery12,13. However, the clinical application prospects of PVAT-derived SVF have not been well explored, which may be attributed to the lack of a standardized method for the isolation of SVF from PVAT. The objective of this protocol is to establish a standardized approach for the isolation, culture, and adipogenic induction of SVF-derived preadipocytes from mouse PVAT surrounding the thoracic aorta, enabling further investigation of PVAT function. This protocol optimizes tissue processing and cell differentiation techniques for culturing periaortic adipocytes obtained from young mice.

Autor em destaque: A importância do isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados de SVF do tecido adiposo perivascular de camundongos 

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

We aim to establish a standardized approach for the isolation culture and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mass PVAT. This protocol enables us to conduct further investigations into PVAT function and into the communication between periaortic adipocytes and vascular cells in vitro. The main challenges we currently face in our experiments include the restricted of availability of PVAT and the requirements for additional human and the material resources when compared to using immortalized preadipocytes.Our protocol allows for the study of perivascular adipose tissue function and it's relationship with vascular cells. We also offers a basis for studying PVAT ring and genes, and heterogeneity, and provides a platform for exploring the important regulator of PVAT differentiation and the adipogenesis in vitro.

Usando este protocolo descrito acima, isolamos cuidadosamente os PVATs ao redor de aortas torácicas de camundongos (Figura 1A-D). Após lavagem e picagem dos PVATs em pequenos pedaços com tesoura estéril (Figura 1E,F), os fragmentos de tecido foram digeridos em solução de digestão contendo colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) e incubados a 37 °C em agitador por 30-45 min (Figura 1G).<strong ...

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Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

Nosso objetivo é estabelecer uma abordagem padronizada para a cultura de isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal a partir de PVAT em massa. Este protocolo permite realizar investigações adicionais sobre a função do PVAT e sobre a comunicação entre adipócitos periaórticos e células vasculares in vitro. Os principais desafios que enfrentamos atualmente em nossos experimentos incluem a restrição de disponibilidade de PVAT e a necessidade de recursos humanos e materiais adicionais quando comparados ao uso de pré-adipócitos imortalizados.Nosso protocolo permite o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares. Nós também oferecemos uma base para estudar o anel e genes PVAT, e heterogeneidade, e fornece uma plataforma para explorar o importante regulador da diferenciação do PVAT e da adipogênese in vitro.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

1.2K visualizações.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Nosso objetivo é estabelecer uma abordagem padronizada para a cultura de isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal a partir de PVAT em massa. Este protocolo permite realizar investigações adicionais sobre a função do PVAT e sobre a comunicação entre adipócitos periaórticos e células vasculares in vitro. Os principais desafios que enfrentamos atualmente em nossos experimentos incluem a restrição de disponibilidade de PVAT e a ne...

Vídeo: Autor em destaque: A importância do isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados de SVF do tecido adiposo perivascular de camundongos 

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Biologia

Dissection and Isolation of Murine Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

Begin by spraying the properly euthanized mouse with 75%alcohol to disinfect the skin. Then place the mouse in a supine position. Lift the skin of the animal's abdominal region, and using surgical scissors, make a small incision in it.Then using the scissors, bluntly separate the skin and abdominal muscles from the pelvis to the neck, along the ventral midline. Expose the heart and lungs by cutting the diaphragm and ribs along both sides of the midline. Next, carefully remove the liver, spleen, bowels, and kidney, avoiding damage to the intestinal wall.Following that, remove the lungs and esophagus. Now gently lift the heart using forceps held in one hand and separate the aorta from the spine with surgical scissors held in the other hand. Then place the heart and aorta in a 60 millimeter petri dish, containing antibiotic supplemented PBS.Retrieve the microsurgical forceps and microsurgical scissors from the alcohol, and rinse them in 25 milliliters of PBS to remove excess alcohol. Working under a stereo microscope, remove the thymus and other tissues from the heart and aorta. Then remove the heart, leaving the aorta with the perivascular adipose tissues or PVATs.Transfer the aorta along with the PVATs to a clean 60 millimeter petri dish containing antibiotic supplemented PBS. Using one pair of microsurgical forceps, hold the aorta, and using another pair, pull off the attached adipose tissues to separate the PVATs from the aorta. Remove as much vascular tissue as possible while causing minimal harm to the PVATs.Finally, transfer the collected PVATs into a two milliliter microcentrifuge tube, containing antibiotic supplemented, high glucose, DMEM, placed on ice.

Dissecção e Isolamento do Tecido Adiposo Perivascular Murino (PVAT)

Isolation of Stromal Vascular Fraction (SVF) from Perivascular Adipose Tissue (PVAT)

While working under a class two laminar flow hood, begin by sequentially washing the perivascular adipose tissues or PVATs collected from mice two times. First, using PBS containing 10%penicillin-streptomycin, and, next, using PBS supplemented with 1%penicillin-streptomycin. Transfer the rinsed tissues into a sterile 60-millimeter Petri dish and add 200 microliters of digestion solution to it.Using sterile scissors, mince the tissues into pieces having a dimension of one cubic millimeter. With the help of sterile scissors, cut a plastic pipette tip to broaden its end. Then transfer the minced tissue mix to a 15-milliliter centrifuge tube using the broad-ended pipette tip.Add six milliliters of the digestion solution to the tissues to initiate digestion. After tying the tube horizontally on a rack, incubate it at 37 degrees Celsius in an orbital shaker for 30 to 45 minutes. Every 5 to 10 minutes, remove the tube from the shaker in the incubator and manually shake it up and down vigorously.Pass the digested tissue mix through a 70-micron cell strainer into a 50-milliliter centrifuge tube. Rinse the strainer with an equal volume of culture medium to maximize cell yield and quench digestion. Transfer the filtrate to a new 15-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube to isolate the stromal vascular fraction or SVF. Invert the tube to discard the supernatant and re-suspend the pellet in five milliliters of PBS. Centrifuge the tube again at 1, 800 G for five minutes before discarding the supernatant.Re-suspend the pellet in an appropriate volume of culture medium. Seed the cells into a collagen-coated 12-well plate and incubate overnight at 37 degrees Celsius in a humid atmosphere with 5%carbon dioxide. On the next day, remove cell debris and red blood cells by aspirating the culture medium and washing the cells with antibiotic-supplemented PBS pre-warmed to 37 degrees Celsius.Finally, add one milliliter of fresh culture medium to each well, and continue culturing the cells until they reach the desired stage of confluency.