Preparar diluição de 12 mililitros de 60% e 70% em tubos cônicos de 50 mililitros. Em seguida, prepare o gradiente de baixo para cima adicionando quatro mililitros de cada vez da diluição de 60% sobre a diluição de 70% usando uma pipeta de cinco mililitros. Em seguida, coloque cuidadosamente 12 mililitros de sangue heparinizado sobre o gradiente de densidade e centrifuja a 200G por 15 minutos à temperatura ambiente.
Descarte as camadas plasmática e de células mononucleares. Em seguida, transfira cuidadosamente aproximadamente 7,5 mililitros da camada acima da pelota de eritrócitos em dois tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugar os tubos a 300G por cinco minutos a 19 graus Celsius.
Proceder à lavagem do pellet celular com Hanks'Balanced Salt Solution ou HBSS. Em seguida, realizar lise hipotônica e remover os glóbulos vermelhos restantes. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda suavemente os polimorfonucleares neutrófilos no tampão restante e transfira-os para um tubo de microcentrífuga gelado.
Em seguida, transfira três alíquotas de um microlitro da suspensão celular para uma lâmina de vidro limpa. Coloração com panóptica rápida para avaliar a morfologia e pureza celular. Observe as células ao microscópio e conte 300 células aleatórias em cada poço.
Marque os neutrófilos e outros tipos celulares para avaliar a pureza da separação. Em seguida, transfira um microlitro da suspensão celular para 49 microlitros de corante azul de tripano a 0,2% e conte as células mortas e viáveis usando uma câmara de Neubauer. Ajustar a concentração celular para 6.667 células por microlitro com 50% de plasma autólogo e 50% de HBSS suplementado com cálcio e magnésio.
Em seguida, divida a suspensão da célula uniformemente entre microtubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro correspondentes às condições de teste, incluindo o controle negativo. Preparar um sistema de ativação para cada condição, garantindo que a concentração celular final permaneça em 6.600 polimorfonucleares neutrófilos por microlitro. Incubar a 37 graus Celsius sem rotação.
