Comece dissolvendo 0,0005 gramas de NBT em 10 microlitros de DMSO. Após vórtice por 15 minutos, adicionar 90 microlitros de Hank's Balanced Salt Solution ou HBSS com cálcio e magnésio e um microlitro das substâncias de teste. Novamente, agite o tubo por até dois minutos.
Para realizar o teste de lâmina NBT, misture e transfira suavemente dois microlitros dos neutrófilos polimorfonucleares ativados previamente preparados em uma lâmina de vidro limpa. Incubar a lâmina em câmara umidificada a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione um microlitro da solução de trabalho NBT sobre as células.
Incubar novamente por 20 minutos, protegendo da luz. Depois de secar a lâmina, fixe-a aplicando uma gota de metanol em cada poço por um minuto. Manchar a lâmina com 0,03 safranina por mais um minuto.
Em cada poço, contar 100 células aleatórias, diferenciando neutrófilos com e sem depósitos de formazana. Para realizar o ensaio de espectrofotometria NBT, misture e transfira suavemente 90 microlitros dos neutrófilos polimorfonucleares ativados previamente preparados para um tubo de microcentrífuga limpo. Em seguida, adicione cuidadosamente 20 microlitros de uma solução de NBT de seis milimolares e incube o tubo no escuro por 37 graus Celsius por 20 minutos.
Após a incubação, adicione 100 microlitros de 10% SDS e Vortex. Sonicate com uma ponta sonicate a 60% de amplitude, adicionando cinco ciclos de 15 segundos cada e intervalos de 15 segundos. Centrifugar a 12.000g por cinco minutos.
Transfira 60 microlitros de sobrenadante para uma placa de fundo transparente de 96 poços e meça a absorbância do produto sobrenadante a 570 nanômetros. Os resultados do ensaio espectrofotométrico indicaram que 100 PMA nanomolares induziram elevada produção de ROS em comparação com os grupos fMLP e controle. Os resultados do teste de lâminas NBT corroboraram os resultados espectrofotométricos, mostrando PMA como o estímulo indutor de produção de ERO mais intenso em comparação com fMLP.
