Para começar, coloque o mouse C57 Black/6 JRj anestesiado. Supino em uma mesa de operação aquecida. Confirme a ausência de respostas reflexas ao pinçamento dos dedos.
Borrife o rato com etanol a 70% para evitar que o cabelo grude na tesoura. Usando tesoura, faça uma incisão abdominal na base, cortando para cima em ambos os lados para a caixa torácica para expor a cavidade abdominal. Use um cotonete para mover os intestinos para a direita, expondo a veia porta.
Usando pinças curvas, coloque duas ligaduras sob a veia porta e amarre livremente cada ligadura. Em seguida, insira um cateter de 0,7 milímetro na veia porta. Quando perfurado, remova a agulha do cateter e guie o cateter através da veia até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado.
Em seguida, aperte as ligaduras. Observe o fígado. Ajuste a taxa de fluxo da bomba de roletes e conecte o tubo de profusão.
Iniciar a profusão do fígado a 37 graus Celsius. Quando o fígado ficar pálido, use uma tesoura para cortar a caixa torácica e o diafragma. Em seguida, com pinça de ponta fina, colocar ligadura sob a veia cava inferior supra-hepática.
Em seguida, insira um cateter na veia cava inferior supra-hepática através do átrio direito do coração. Quando perfurado, remova a agulha e guie o cateter pela veia mais próxima do fígado. Em seguida, aperte a ligadura.
Fixar um tubo para a coleta do efluente de perfusão e fixar todos os tubos com fita impermeável. Usando um adaptador de pinça de vaso, coloque uma pinça de vaso em toda a veia cava infra-hepática imediatamente acima da veia renal direita para evitar mistura morta. Em seguida, aumente o fluxo de perfusão para 3,5 mililitros por minuto.
Inicie o temporizador e a gravação da pressão. Cubra o fígado com um pano estéril umedecido com soro fisiológico, equilibre por 30 minutos e meça o volume de efluente. Após 30 minutos de equilíbrio, iniciar o experimento para a primeira coleta de amostra basal no coletor de frações.
Monitore o coletor de bolhas regularmente e reencha com tampão de perfusão quando estiver perto de vazio. Coletar uma amostra tampão através de uma torneira de três vias imediatamente antes de entrar no órgão e do cateter coletor inserido na veia cava inferior. Usando um analisador de gases sanguíneos, meça a amostra coletada para confirmar que o órgão está metabolicamente ativo.
Após 15 minutos de perfusão basal, usando uma bomba de seringa, iniciar a primeira estimulação infundindo uma substância de teste através de uma torneira de três vias na taxa de fluxo desejada. Após a simulação, coletar amostras basais por 20 a 30 minutos antes de iniciar a segunda estimulação. A produção de ureia no fígado perfundido com períodos basais estáveis precedendo cada um dos dois períodos de estimulação sugeriu que a resposta da ureia a dois estímulos consecutivos com aminoácidos mistos é consistente.
Observou-se liberação basal constante de glicose e ácidos graxos não-esterificados. Antes de um aumento robusto de glicose e ácidos graxos não-ED durante a infusão de glucagon. O valor médio no estado basal e durante a infusão de glucagon sugere que o glucagon estimula rapidamente a glicogenólise hepática e a lipólise.
No entanto, sem períodos basais estáveis, torna-se impossível distinguir uma resposta de ureia da seguinte.
