Comece incubando as fibras musculares esqueléticas de ratos com TMRE à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, inicie o software padrão do microscópio confocal e escolha a estrutura de configuração. Na caixa de diálogo Configuração de hardware, selecione Laser e marque a opção Hélio Neon 543.
Acesse a caixa de diálogo de aquisição por meio da estrutura Adquirir e selecione o painel XYZ. Em seguida, selecione o formato 512x512 com uma velocidade de 400 hertz. No painel pinhole exibido, selecione unidades arbitrárias e insira três áreas para o pinhole.
Na caixa de diálogo Configurações do Bean Path, selecione uma objetiva de imersão em água de 20 x com uma abertura numérica de 0,7 e uma janela de comprimento de onda de emissão de 576 a 700 nanômetros. Escolha DD 488543 e defina a potência do laser para o laser 543 em 15% Após uma incubação de 20 minutos, troque o meio de incubação duas vezes. Em seguida, prepare a câmara de gravação com uma tampa de vidro de silicato de boro de 0,15 milímetro.
Transfira os feixes de fibras para a câmara contendo 200 microlitros de solução relaxada. Utilizar o modo de campo brilhante do microscópio confocal para identificar fibras viáveis para o registro fluorescente de mitocôndrias. Ajuste, ganhe e compense escaneando a fluorescência usando o botão Ativa.
Escolha valores de baixa intensidade fluorescente para um fundo de quase zero unidades arbitrárias e um sinal mitocondrial entre 100 e 200 unidades arbitrárias. Selecione um tamanho de pixel entre 150 e 190 nanômetros e ajuste o fator de zoom na caixa de diálogo XY para adquirir a largura total da fibra. Na caixa de diálogo da pilha Z, defina a distância Z começando em uma profundidade de fibra de 15 micrômetros até 22 micrômetros e escolha um tamanho de passo Z de 3 micrômetros.
Clique no botão Iniciar para adquirir as imagens confocais e obter uma pilha Z composta por três imagens confocais adquiridas a 15, 18 e 21 micrômetros de profundidade. As imagens confocais de uma fibra muscular magra exercitada mostram um registro esperado de mitocôndrias de fibras musculares esqueléticas com um padrão de fibra consistente. Em contraste, a fibra muscular de ratos obesos apresenta alterações substanciais no conteúdo e distribuição mitocondrial.
