Depois de construir e alinhar o sistema de microscópio de dois fótons sensível à polarização, de acordo com a representação esquemática exibida, teste a qualidade do alinhamento óptico com uma amostra de referência isotrópica como a fluoresceína incorporada em um polímero amorfo. Para fazer isso, ligue o laser de excitação e meça os gráficos polares de 360 graus da amostra de referência para uma placa de meia-onda zero. Ajustar o ângulo da placa de meia-onda para corresponder aos eixos X e Y do plano da amostra e verificar se ambos os fotodiodos coletam intensidades semelhantes de dois componentes de emissão excitados por fótons.
Para análise da amostra, montar a lâmina de vidro com este esfércime de esferulito no Palco Piezoelétrico, garantindo que a face da lâmina contendo a tampa fique voltada para a objetiva de imersão de alta abertura numérica. Em seguida, prenda a lâmina de vidro com fita adesiva. Em seguida, ajustando as posições X, Y e Z usando os botões do microscópio, concentre a objetiva na esferulita na solução.
Concentre-se especificamente na área central de toda a estrutura, pois os diâmetros de esferulitos geralmente estão na faixa de dezenas de mícrons. Em seguida, centralize esta esferulita no campo de visão no plano do microscópio. Determine o tamanho da varredura XY ajustando o número de etapas do Piezo Stage nas direções X e Y para cobrir toda a área da estrutura.
Ajuste os parâmetros do Piezo Stage, como velocidade de varredura, tamanho do passo e alcance para cobrir a área de todo o esferulito. Abra o obturador, ligue os fotodiodos e colete os componentes de emissão X e Y da intensidade de fluorescência excitada de dois fótons para cada passo da área de varredura selecionada para o feixe de excitação polarizado correspondente aos eixos X e, em seguida, Y. Em seguida, digitalize essa amostra de esferulite, resultando em fluorescência excitada de dois fótons.
Para realizar a análise de polarização total a partir do ponto específico da amostra, desligue o feixe de excitação. Tome coordenadas específicas do Estágio Piezo correspondentes ao local escolhido nesta esferulite, onde a informação sobre a orientação das moléculas é necessária com a resolução submícron. Ajuste o Estágio Piezoelétrico para centralizar o campo de visão nas coordenadas X e Y indicadas.
Depois de ligar o feixe de excitação, ligue a rotação de 180 graus da placa de meia-onda para realizar uma análise completa de polarização de 360 graus dos componentes de emissão X e Y da emissão de fluorescência excitada de dois fótons. A imagem da esferulita de insulina obtida após a realização de um raster de 2PFM foi consistente com as relatadas para uma esferulite. A posição da placa de meia-onda correspondente à excitação da amostra ao longo dos eixos X e Y também foi verificada.
Os gráficos polares mudaram durante a realização de uma análise de polarização completa a partir de diferentes pontos selecionados. Fora do esferulite, o gráfico PLO parecia uma coleção de artefatos e picos de ruído de sinal aleatórios. Polígrafos adequadamente medidos de locais altamente ordenados ao longo dos eixos X e Y tinham diferentes formas e geometrias dependendo da orientação local e organização dos fluoróforos.
