Para começar, use tesouras ou tesouras para serviço pesado para cortar a extremidade da tampa a 0,5 milímetros do fundo cônico de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque um pedaço de lã de vidro no tubo cortado para cobrir o orifício central. Coloque uma unidade de filtro de lã de vidro montada em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e rotule o tubo.
Em seguida, corte uma placa PCR de 96 poços sem contornos em seis racks de suporte de duas colunas. Vire os racks de duas colunas para que os fundos cônicos dos poços fiquem voltados para cima. Coloque a prateleira em uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro úmido e cubra com a tampa para criar uma câmara de umidade para as bainhas das folhas.
Para colher conídios do esporulante Colletotrichum graminicola, adicione três a quatro mililitros de água deionizada estéril na placa. Usando um pilão de ponta cônica estéril, raspe uniformemente em toda a placa para soltar os esporos do ágar. Adicione assepticamente um mililitro de suspensão de esporos em uma unidade de filtro de lã de vidro e permita que os esporos fluam para o tubo de coleta por gravidade.
Centrifugar a suspensão de esporos filtrados a 3.500 G por cinco minutos e despejar o líquido em um recipiente autoclavável. Adicione um mililitro de água deionizada estéril no tubo de coleta e agite suavemente para ressuspender os esporos peletizados. Novamente, centrifugar a suspensão e ressuspender os esporos para quantificação em 300 a 500 microlitros de água deionizada.
Use um hemocitômetro sob um microscópio composto em aumento de 100 vezes para determinar a concentração de esporos. Em seguida, prepare 500.000 esporos por mililitro de suspensão com água deionizada. Retirar a bainha da primeira folha verdadeira das mudas da semana dois.
Passe uma miniatura ao longo da margem sobreposta da bainha e solte-a suavemente da calha. Corte a bainha foliar recuperada em segmentos de três a cinco centímetros. Desenrolar cuidadosamente cada segmento para expor a camada epidérmica interna.
Aplicar 20 microlitros de suspensão de esporos fúngicos na superfície interna no centro da bainha acima da nervura central. Colocar as bainhas foliares inoculadas horizontalmente, com uma nervura central posicionada na parte inferior, em uma placa de Petri de vidro contendo papel de filtro umedecido. Em seguida, coloque as pequenas câmaras de umidade em uma caixa de armazenamento transparente forrada com papel de germinação umedecido, cubra a caixa de armazenamento com uma tampa e incube a 23 graus Celsius sob iluminação contínua para o curso de tempo pretendido.
Verifique regularmente as caixas para sinais de doença nas bainhas.
