Para realizar SPR para interações BVS-MZ1, primeiro ative o chip de estreptavidina, de acordo com as instruções do fabricante: Para fazer a maior concentração, adicione um tampão livre de DMSO ao MZ1 para garantir uma concentração de 2% de DMSO. Agora pipetar 50 microlitros da solução de maior concentração em um poço contendo 100 microlitros do tampão de corrida. Misture bem para configurar a segunda maior concentração.
Em seguida, transfira 50 microlitros da solução para os próximos 100 microlitros de tampão de corrida, misture bem para preparar a terceira maior concentração e assim por diante. Use folhas plásticas transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de polipropileno para cobrir a placa. Inicie o SPR usando a configuração de vários ciclos.
Ajuste o modo em alto desempenho, o tempo de contato em 120 segundos, o tempo de dissociação em 300 segundos e a taxa de fluxo em 50 microlitros por minuto. Utilizar o software de avaliação fornecido pelo fabricante do instrumento para executar a análise dos dados. Para realizar a SPR para o complexo ternário BVS-MZ1-BRD4, primeiro ative a estreptavidina.
Injetar solução BVS para imobilizá-la em aproximadamente 100 unidades de ressonância. Para o controle negativo utilizando apenas BRD4, preparar a maior concentração de 25 micromolares no tampão de corrida com um volume de 200 microlitros. Aos próximos quatro poços, adicione 160 microlitros cada de dois micromolares BRD4.
Transfira 40 microlitros do poço A5 para o A4. Em seguida, pipetar o poço para misturar bem. Da mesma forma, transferir 40 microlitros do poço A4 para A3, continuando este processo até atingir A1. Para a formação de complexos ternários com MZ1 e BRD4, pipetar 196 microlitros de solução BRD4 25,5-micromolar. Para isso, adicione quatro microlitros de MZ1 20-micromolar preparados em solução 100% DMSO.
Pipetar 160 microlitros de BRD4 a dois micromoles no tampão de corrida para os próximos quatro poços à esquerda. Em seguida, transfira 40 microlitros do poço B5 para o B4 e pipeta para misturar completamente. Continue a transferir a solução de cada poço até B1. Agora execute o SPR para a configuração de ciclo único com um tempo de contato de 100 segundos, um tempo de dissociação de 720 segundos e uma taxa de fluxo de 50 microlitros por minuto.
Foi realizada a caracterização do complexo binário BVS-MZ1 e do complexo ternário BVS-MZ1-BRD4. Observou-se cooperatividade positiva. A caracterização do sistema cereblon, PROTAC e PPM1D foi realizada pela SPR.
Os experimentos PPM1D usam um chip NTA de níquel, e a superfície do chip é regenerada após cada injeção de composto. BRD-2512, que só se liga ao cereblon, e BRD-4761, que só se liga ao PPM1D, mostram uma resposta de ligação insignificante. BRD-5110 induz a formação de um complexo ternário entre PPM1D e mostra um efeito gancho em altas concentrações de compostos.
