Este trabalho foi apoiado por um prêmio de Inovação e Desenvolvimento de Tecnologia do Centro para o Desenvolvimento de Terapêuticas do Broad Institute of MIT e Harvard. Os autores agradecem aos membros da equipe de liderança sênior e ao comitê de revisão pelo apoio a este trabalho.

Todas as proteínas foram superexpressas em E.coli com bom rendimento e pureza (>80%), seguindo os protocolos daliteratura18. A biotinilação foi realizada utilizando-se reação catalisada por BirA18. Todas as moléculas pequenas foram preparadas em soluções estoque de 1 mM em DMSO 100%. Os procedimentos aqui descritos não requerem equipamentos ou precauções laboratoriais especializadas de segurança. Equipamentos de proteção individual (EPIs) padrão de laboratório devem ser usados (por exemplo, jaleco, óculos de segurança e luvas).
As proteínas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo: BVS: complexo biotinilado BVS(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) com Avi-tag no terminal C de ElonginB. Brd4BD2: Não marcado Brd4BD2(333-460) CRBN: CRBN biotinilado (319-442) com Avi-tag no terminal N PPM1D: PPM1D(1-420) não marcado ou duplo His8-tagged no terminal N
Pequenas moléculas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo: MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC que se liga à BVS e Brd4BD2 BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN KD ~3 μM, não se liga ao PPM1D BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM BRD-4761 (MW = 476,6 Da): não se liga ao CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM
1. Método 1: ITC (calorimetria de titulação isotérmica)
OBS: As titulações são realizadas utilizando-se um microcalorímetro com auto-injeção.
<ol><li>Preparação tampão: Preparar 3 L de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.</li>
	<li>Diálise: Dialyze BVS e Brd4BD2 (~ 500 μL a 150 μM cada) contra 1 L do tampão preparado na etapa 1.1, 3 vezes a 4 °C, por 4 h, 2 h e aproximadamente 16 h, respectivamente. Salve o buffer após a última diálise para uso nas etapas subsequentes.</li>
	<li>Prepare amostras em uma placa de 96 poços com uma tampa plástica.<ol><li>Para cada titulação, preparar 400 μL de solução para a célula, 125 μL para a seringa e 400 μL de tampão para limpeza. Adicione amostras a três poços consecutivos na placa. Uma vez que o estoque composto é preparado a 1 mM em 100% DMSO, adicione a mesma porcentagem de DMSO às soluções proteicas para garantir o tampão correspondente na célula e na seringa. Adicionar 2% de DMSO às soluções finais.<ol><li>Amostra para titulação de BVS em MZ1: Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 4 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 10 μM) e 4 μL de DMSO a 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO 100% (concentração final de 84 μM).</li>
			<li>Amostras para titulação da BVS no tampão (os dados serão utilizados para subtração de fundo dos dados gerados a partir da amostra 1.3.1.1): Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 8 μL de 100% de DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, (concentração final de 84 μM) e adicionar 2,5 μL de DMSO a 100%.</li>
			<li>Amostras para titulação de BVS em MZ1 e Brd4 BD2: Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4BD2 (concentração final de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 8,4 μM) e 4,64 μL de DMSO 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.</li>
			<li>Amostras para titulação de BVS em Brd4 BD2 (fundo de 1.3.1.3): Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4BD2 (concentração final de 16,8 μM) e 8 μL de 100% DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Execute as quatro titulações no microcalorímetro. Cada uma consiste em 19 injeções de solução de seringa de 2 μL a uma taxa de 2 μL/s em intervalos de tempo de 120 s. Fazer uma injeção inicial de proteína (0,4 μL) e descartá-la durante a análise dos dados. Realizar todos os experimentos a 25 °C, agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Análise dos dados: Ajustar os dados a um modelo de sítio de ligação única para obter a estequiometria (n), a constante de dissociação (KD) e a entalpia de ligação (ΔH) usando o software de análise fornecido pelo fabricante (Figura 2).</li>
</ol>2. Método 2: BLI (interferometria da biocamada)
<ol><li>Realizar experimentos de BLI usando sensores revestidos com estreptavidina (SA) à temperatura ambiente (TR) com uma taxa de aquisição de 5 Hz. Durante o experimento automatizado BLI, certifique-se de que os sensores estejam estacionários dentro de uma única coluna e se movam entre diferentes colunas de uma placa preta de fundo plano de 96 poços com um volume máximo de poço de 392 μL. Encher cada poço da placa usada no experimento com 200 μL de solução. NOTA: BLI só é útil para detectar interações proteína-proteína (ou seja, formação de complexo ternário). Não é sensível o suficiente para detectar interações entre proteínas e pequenas moléculas.<ol><li>Preparação tampão: Preparar 100 mL de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.</li>
		<li>Otimização para a etapa de imobilização: Carregar o sensor de teste para 1-3 nm, conforme recomendado pelo fabricante. Um carregamento de ~1,0 nm é usado para os procedimentos descritos aqui. Para isso, mergulhe o sensor em uma solução contendo BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.</li>
		<li>Realizar medições cinéticas BLI aplicando sete sensores SA usando a seguinte sequência:<ol><li>Para a primeira fase basal, mergulhe em buffer por 60 s.</li>
			<li>Para a fase de imobilização, mergulhar em uma solução de BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.</li>
			<li>Para a segunda fase basal, mergulhe em tampão por 60 s.</li>
			<li>Para a fase de associação, mergulhar em solução de uma concentração fixa de Brd4BD2 a 2 μM, concentração fixa de DMSO a 2% e concentrações variáveis de MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensor de referência) por 300 s.</li>
			<li>Para a fase de dissociação, mergulhe em tampão por 600 s.</li>
		</ol></li>
		<li>Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. k on, koff e KD são relatados para ajuste dos dados (Figura 3).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Método 3: SPR (ressonância plasmônica de superfície)
NOTA: Todos os experimentos de SPR são realizados usando chips de sensor revestidos com estreptavidina (SA) no RT. Embora o chip NTA seja usado para a detecção entre proteína e pequenas moléculas, ele deve ser usado com cautela quando aplicado ao complexo ternário, pois um fundo muito mais alto do que o chip SA é observado, possivelmente devido a interações eletrostáticas entre a superfície do chip carregado e a proteína no analito.
<ol><li>SPR para interação BVS-MZ1<ol><li>Preparação do tampão.<ol><li>Prepare um tampão de 1 L contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e passe por uma unidade de filtro de 0,2 μm.</li>
			<li>Retirar 20 ml de tampão para utilização futura (tampão sem DMSO) e encher novamente com 20 ml de DMSO (DMSO a 2% no tampão de execução final). Manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.1 e 3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS a ~2000 RU (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Prepare MZ1 em uma diluição seriada de 3 vezes e 8 pontos com a concentração superior a 10 μM em uma placa de polipropileno translúcida de fundo cônico de 384 poços com um volume máximo de 130 μL. Cubra a placa com folhas plásticas transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de polipropileno.<ol><li>Prepare a concentração máxima com o tampão livre de DMSO para garantir o DMSO a 2% na concentração final. Para 147 μL de tampão livre de DMSO, adicionar 1,5 μL de estoque de MZ1 a 1 mM e 1,5 μL de DMSO 100%.</li>
			<li>Prepare a diluição em série de 3 vezes com o tampão de corrida contendo DMSO a 2%. A 100 μL do tampão de corrida, adicionar 50 μL de solução na concentração máxima preparada no passo 3.1.3.1 e misturar bem para preparar a2.ª concentração mais elevada.</li>
			<li>Em seguida, transfira 50 μL da solução preparada na etapa 3.1.3.2 para os próximos 100 μL de tampão de corrida, misture bem para preparar a3ª maior concentração e assim por diante.</li>
		</ol></li>
		<li>Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 120 s; tempo de dissociação: 300 s; vazão: 50 μL/min.</li>
		<li>Realizar a análise dos dados utilizando o software de avaliação fornecido pelo fabricante do instrumento. A análise de estado estacionário indicou KD = 26 (± 3) nM e Rmax de ~91% (± 5%) de ligação alcançada (Figura 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para BVS: MZ1: Complexo ternário Brd4BD2<ol><li>Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.1.1.</li>
		<li>Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS para ~100 RU. Injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL VHL a uma taxa de fluxo de 5 μL/min e tempo de contato entre 1-5 min até atingir uma densidade de superfície de ~100 RU.</li>
		<li>Preparar amostras para duas injecções de ciclo único de 5 vezes e 5 pontos numa placa de fundo redondo de poliestireno transparente de 96 poços com um volume máximo de 323 μL e cobri-la com folhas de plástico transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de poliestireno, conforme descrito nos passos 3.2.3.1-3.2.3.2.<ol><li>Controlo negativo: a substância a analisar contém apenas Brd4BD2 .<ol><li>Preparar concentração máxima a 25 μM em tampão de corrida com um volume de 200 μL (#A5)</li>
				<li>Adicionar 160 μL cada de Brd4BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#A1-A4)</li>
				<li>Transferir 40 μL de A5 para A4. Misture bem.</li>
				<li>Transferir 40 μL de A4 para A3. Misture bem. Continue fazendo isso até A1.</li>
			</ol></li>
			<li>Formação do complexo ternário: o analito contém MZ1 e Brd4BD2.<ol><li>Preparar a concentração máxima adicionando 4 μL de MZ1 a 20 μM em solução de DMSO a 100% para 196 μL contendo 25,5 μM Brd4BD2 em tampão livre de DMSO (#B5). As concentrações finais são 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.</li>
				<li>Adicionar 160 μL cada de Brd4BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#B1-B4)</li>
				<li>Transferir 40 μL de B5 para B4. Misture bem.</li>
				<li>Transferir 40 μL de B4 para B3. Misture bem. Continue fazendo isso até B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Tempo de contato: 100 s; tempo de dissociação: 720 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada amostra para garantir um fundo estável.</li>
		<li>Análise dos dados: Aplicar a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, quando MZ1 não está presente, a resposta SPR entre BVS e Brd4BD2 é desprezível. Quando MZ1 está presente, o ajuste cinético indica que a interação entre BVS e o complexoBD2 MZ1-Brd4 tem k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 e KD = 1 nM. (Figura 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para interações CRBN e pequenas moléculas<ol><li>Preparação do tampão.<ol><li>Prepare um tampão de 1 L contendo 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, e passe por uma unidade de filtro de0,2 μm.</li>
			<li>Retirar 20 ml de tampão e reabastecer 20 ml de DMSO a 100% (DMSO a 2% no tampão de execução final). É importante manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.3, 3.4 e 3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>Ative o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilize o CRBN para ~800 RU.</li>
		<li>Preparar compostos em diluição em série de 3 vezes e 6 pt numa placa de 384 poços com uma concentração máxima de 30 μM, conforme descrito no ponto 3.1.3.</li>
		<li>Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho, tempo de contato: 60 s, tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min. Para este sistema, três injeções de buffer são suficientes para obter um fundo estável. Para outros sistemas de ensaio, pode ser necessário realizar injeções de tampão adicionais.</li>
		<li>Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. NOTA: A análise de estado estacionário indica que KD de BRD-2512 e BRD-5110 estão ambos em torno de 3 μM. No entanto, a ligação só atingiu ~ 70% Rmax ligação na concentração superior. Tanto a fraca afinidade quanto a forma do sensorgrama indicam que a insolubilidade do composto em altas concentrações é provável de acontecer. Assim, a KD real pode ser maior que 3 μM. O BRD-4761, que não se liga ao CRBN, foi incluído como controle negativo.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para interações PPM1D e pequenas moléculas<ol><li>Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1. Use um chip sensor de ácido nitriloacético (NTA).</li>
		<li>Aplique um único ciclo porque a ogiva PPM1D tem um k ligado e kdesligado lento. Gere novamente o chip NTA usando a configuração padrão do fabricante e imobilize PPM1D para ~ 1000 RU após cada injeção de composto (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparar os compostos em diluição em série de 3 vezes e 5 pontos com a concentração máxima a 400 nm, conforme descrito no ponto 3.1.3.</li>
		<li>Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Modo: alto desempenho; tempo de contato: 90 s; tempo de dissociação: 600 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada composto para garantir um fundo estável.</li>
		<li>Análise de dados. Aplique a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, o BRD-2512 não apresenta ligação ao PPM1D. Para BRD-4761 e BRD-5110, o ajuste cinético indicou que o KD para ambos era de 1-2 nM.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR para CRBN:PROTAC: complexo ternário PPM1D<ol><li>Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1.</li>
		<li>Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar CRBN para ~35 RU (injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL a 5 μL/min).</li>
		<li>Preparar três compostos em diluição seriada de 3 vezes e 6 pontos com uma concentração máxima de 30 μM, mantendo [PPM1D] a 1 μM em todas as amostras, incluindo os espaços em branco, utilizando o método descrito no passo 3.2.3.</li>
		<li>Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 60 s; tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min.</li>
		<li>Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. NOTA: Enquanto o BRD-2512 e o BRD-4761 mostram resposta não/desprezível, o BRD-5110 mostra claramente o "efeito gancho" no estado estacionário com cinética liga/desliga rápida (Figura 5A-C). A resposta de ligação experimental do BRD-5110 (Figura 5C) está entre a resposta prevista da simulação ao assumir que K D (CRBN, cpd) é de 3 ou 10 μM (Figura 5E), sugerindo que o ternário K D e o binário K D são muito semelhantes. Não há cooperatividade aparente do PPM1D: BRD-5110: formação do complexo CRBN.</li>
	</ol></li>
</ol>

Caracterização da formação de complexos ternários em PROTACs usando ensaios biofísicos

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. 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H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

A caracterização biofísica das interações binárias e ternárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode fornecer informações únicas e complementares relativas a sistemas celulares amplamente utilizados. Compreender a afinidade entre cada ogiva de uma molécula PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode ajudar a orientar os esforços de química medicinal para a otimização dessas interações. Estruturas cristalinas de complexos ternários PROTAC previamente public...

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase 1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas3. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma4. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença5. Pequenas moléculas que induzem a interação entre as ligases de ubiquitina E3, como a ligase E3 de Von Hippel-Lindau (BVS) ou o cereblon (CRBN), são tipicamente compostas por uma ogiva de ligação à ligase E3 conectada por um ligante flexível a uma ogiva que se liga à proteína alvo de degradação. Essas moléculas heterobifuncionais são comumente referidas como proteólise visando quimeras ou PROTACS6.
O desenvolvimento do PROTACS envolve a avaliação da capacidade das moléculas de induzir a degradação de proteínas nas células. Muitos sistemas de ensaios celulares foram desenvolvidos para monitorar a interação induzida entre a proteína-alvo e os componentes da ligase E3, como VHL ou CRBN, após o tratamento das células com uma molécula de PROTAC. Um desses ensaios celulares, o sistema nanoluc-Halotag7, envolve uma ligase E3 fundida ao aceitador Halotag e uma proteína-alvo marcada com um doador nanoluc. A formação do complexo ternário aproxima o doador nanoluc e o aceitador Halotag, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor, resultando na emissão de luz. Variações desse sistema podem ser usadas para avaliar a permeabilidade celular de moléculas de PROTACS8 ou mudanças no nível relativo de ubiquitinação de proteínas-alvo9. Enquanto esses sistemas celulares são essenciais para impulsionar a otimização do PROTACS, a formação de complexos entre os ligases E3 e as proteínas alvo de degradação é um processo de várias etapas10,11. A cinética e termodinâmica das interações binárias e ternárias envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína12,13,14.
São descritos protocolos que podem ser adaptados para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTACS utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os protocolos SPR e ITC para a molécula MZ1 PROTAC que induz a formação de complexos ternários entre Brd4BD2 e BVS, derivados de relatos da literatura13,15 e aqui descritos, foram capazes de recapitular os resultados relatados com algumas modificações dos procedimentos relatados, que serão discutidos. Uma descrição de um ensaio de BLI usado para avaliar a formação de complexos ternários entre MZI, Brd4BD2 e BVS está incluída neste relatório. As medidas de afinidade do IPC foram consistentes com as observadas na RP e na CIT. Um protocolo publicado anteriormente no qual um ensaio de SPR foi desenvolvido para avaliar a formação de complexo ternário induzido por PROTAC entre PPM1D, uma proteína fosfatase Ser/Thr cuja expressão é induzida de forma p53-dependente16, e CRBN também é descrito. Neste caso, a molécula PROTAC tem uma afinidade nanomolar para PPM1D, mas apenas uma afinidade micromolar para CRBN. Neste caso, a ligação da molécula de PROTAC ao CRBN não é saturável, resultando no comumente observado "efeito gancho". O efeito gancho é uma propriedade de três sistemas corporais em que existem duas espécies que podem formar um complexo heterotrimérico quando ambas estão ligadas a uma molécula em ponte (Figura 1)17. O efeito gancho é observado quando a espécie em ponte está em concentração excessiva em relação às outras duas espécies. O estado resultante é aquele em que as interações binárias superam as interações ternárias. Os sistemas onde o efeito gancho é observado requerem considerações específicas de planejamento experimental discutidas neste relatório. Conceitos gerais e requisitos de reagentes para avaliar a utilização de ensaios biofísicos para a avaliação da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTAC são fornecidos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

Ligases E3 e proteínas alvo de degradação podem ser induzidos a formar complexos por moléculas heterobifuncionais em um processo de várias etapas. A cinética e termodinâmica das interações envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína. Técnicas biofísicas como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) fornecem informações valiosas que podem ser usadas na otimização dessas interações. Usando dois sistemas modelo, um kit de ferramentas de ensaio biofísico para entender a cooperatividade da formação de complexos ternários e o impacto do 'efeito gancho' na cinética de ligação foi estabelecido. Em um caso, uma proteólise visando quimera (PROTAC) molécula que induziu a formação de complexo ternário entre Brd4BD2 e VHL foi avaliada. A molécula heterobifuncional, MZ1, tem afinidades nM tanto para a proteína Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) quanto para o complexo VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Para esse sistema, foram desenvolvidos ensaios robustos de SPR, BLI e ITC que reproduzem resultados publicados demonstrando a cooperatividade da formação ternária de complexos. No outro caso, foi estudada uma molécula que induziu complexos ternários entre uma proteína de 46,0 kDa, PPM1D, e o cereblon [CRBN (319-442)]. A molécula heterobifuncional, BRD-5110, tem um SPR K D = 1 nM para PPM1D, mas uma ligação muito mais fraca contra o complexo CRBN truncado (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). Nesse caso, a vinculação para CRBN em SPR não foi saturável, resultando em um "efeito gancho". Os requisitos de rendimento e reagente para SPR, BLI e ITC foram avaliados, e recomendações gerais para sua aplicação em projetos PROTAC foram fornecidas.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

Autor em destaque: Avaliação de ensaios biofísicos para caracterização de complexos ternários PROTACS 

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

A caracterização da BVS: complexo binário MZ1 e BVS: MZ1: complexo ternárioBrd4 BD2 pode ser encontrada na Figura 2 (ITC), Figura 3 (BLI) e Figura 4 (SPR) usando um buffer muito semelhante. O KD extraído dos ensaios ortogonais é consistente. A cooperatividade pode ser calculada por K D (binário) / KD (ternário), o que é altamente positivo (15 do ITC ou 26 do SPR).
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Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN). Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Nossa pesquisa se concentra em replicar sistemas modelo estabelecidos, validá-los por meio de ensaios adicionais e adaptar essas metodologias para se adequar ao nosso contexto específico de pesquisa. Nosso objetivo é demonstrar uma abordagem versátil que pode ser aplicada a vários projetos. O desafio experimental atual, o licenciamento seleciona estrategicamente o formato e as condições apropriadas do ensaio com base nos requisitos específicos do projeto e nas lacunas de conhecimento existentes.Isso é essencial para alcançar respostas eficientes e precisas em nossos experimentos. Nosso protocolo fornece uma abordagem simplificada para uma adaptação perfeita a vários sistemas ProTech. Além disso, realizamos uma avaliação criteriosa de cada método, destacando seus respectivos prós e contras.Oferecemos instruções informadas sobre a escolha do formato mais adequado com base em condições específicas.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K visualizações.  The Broad Institute of MIT and Harvard. Nossa pesquisa se concentra em replicar sistemas modelo estabelecidos, validá-los por meio de ensaios adicionais e adaptar essas metodologias para se adequar ao nosso contexto específico de pesquisa. Nosso objetivo é demonstrar uma abordagem versátil que pode ser aplicada a vários projetos. O desafio experimental atual, o licenciamento seleciona estrategicamente o formato e as condições apropriadas do ensaio com base nos requisitos específicos do projeto e nas lacunas de conhecimento ...

Vídeo: Autor em destaque: Avaliação de ensaios biofísicos para caracterização de complexos ternários PROTACS 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).