Para preparar os poços de cultura, marque a tampa de uma placa de 24 poços com o código do doador A ou B, a data e a dose. Retire os frascos para injetáveis de crio contendo sangue humano do azoto líquido e descongele-os parcialmente no banho de água morna até que sejam vistos pequenos cristais de gelo. Em seguida, em uma coifa de fluxo laminar, abra cuidadosamente o frasco para injetáveis para evitar que bolhas de ar se derramem dentro do tubo.
Ressuspenda e transfira o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enquanto gira suavemente o tubo, gota a gota, adicione um mililitro de PBS pré-aquecido. Use uma pipeta P-1000 para misturar PBS e sangue.
Para uma diluição e lavagem uniforme, adicione sete mililitros de PBS pré-aquecido ao tubo de 15 mililitros e misture por pipetagem. Centrifugar o sangue a 180 g durante oito minutos. Enquanto isso, encha os poços não rotulados de uma placa de 24 poços com 500 microlitros de PBS e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius.
Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro no tubo sem perturbar a paleta. Usando uma pipeta, ressuspenda a paleta no sobrenadante restante. Em seguida, adicione gradualmente oito mililitros de PBS quente no tubo, como demonstrado anteriormente.
Centrifugar o sangue ressuspenso. Enquanto isso, adicione 200 microlitros de meio de cultura RPMI aos poços marcados e pré-aqueça a placa conforme demonstrado. Após a centrifugação, retirar o sobrenadante, deixando aproximadamente 80 microlitros do sobrenadante.
Em seguida, adicione 280 microlitros de soro fetal de bezerro e ressuspenda a paleta. Transfira 180 microlitros da suspensão celular para os poços marcados. Incube a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 10 minutos.
