Após a cultura da amostra de sangue criopreservado descongelado, irradiá-la com as doses de raios X necessárias à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 1,62 mililitros de meio de cultura RPMI quente a cada poço. Para estimular a divisão celular em linfócitos T, adicione 40 microlitros de fitohemaglutinina a cada poço e ressuspenda completamente.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 23 horas. No dia seguinte, adicionar oito microlitros de citocalasina B por poço para bloquear a citocinese. Após 70 horas, remova a placa da incubadora e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.
Enxágue cada poço com dois mililitros de PBS e adicione este PBS ao tubo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 180 G por oito minutos e descartar o sobrenadante, deixando 500 microlitros sobre o pellet. Ao agitar o pellet, adicione dois mililitros de cloreto de potássio frio no tubo.
Novamente, centrifugar e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Vórtice o pellet adicionando lentamente dois mililitros de fixador frio 1 e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, centrifugar e descartar o sobrenadante.
Enquanto agita o pellet drop-wise, adicione dois mililitros de fixador frio 2 ao tubo. Deixe o tubo durante a noite a quatro graus Celsius. Centrifugar a amostra e transferir o sobrenadante para outro tubo para concentrar as células de acordo com o tamanho do pellet.
Limpe as lâminas com isopropanol e rotule-as corretamente. Depois de agitar o pellet, adicione 40 microlitros de suspensão de célula fixa em uma lâmina. Após a secagem, mergulhe a lâmina em coloração de laranja acridina por um minuto.
Em seguida, lave a lâmina rapidamente com água destilada antes de colocá-la em um tampão fosfato por um minuto. Seque a parte de trás da lâmina e coloque-a sobre papel de seda limpo. Adicione 20 microlitros de tampão fosfato na lâmina e cubra com uma tampa limpa, evitando bolhas de ar.
Sele a corrediça com cimento de silicone. Coloque a lâmina sob um microscópio fluorescente e examine as células binucleadas. Finalmente, conte manualmente os micronúcleos.
A presença de células binucleadas arredondadas indicou recuperação bem-sucedida de células viáveis saudáveis de amostras criopreservadas de sangue total. Com o aumento das doses de radiação, observou-se um aumento linear quadrático no rendimento dos micronúcleos. Os rendimentos do micronúcleo de fundo em amostras controle irradiadas por simulação resultaram principalmente de cromossomos retardatários.
