Para começar, tome 10 mililitros da amostra de água da diatomácea em um tubo de centrífuga. Centrifugar o tubo a 13, 400 G durante cinco minutos. Com uma pistola de pipeta, descarte cuidadosamente 9,8 mililitros do sobrenadante.
Em seguida, transfira 200 microlitros da amostra de água de diatomácea enriquecida para um tubo de centrífuga de dois mililitros. Em seguida, tome 0,5 gramas de tecido da margem pulmonar de um corpo humano afogado. Com a tesoura, corte o tecido pulmonar até ficar lamacento.
Para extração de DNA de amostras de diatomáceas e pulmão, primeiro adicione contas de vidro a ambas as amostras. Depois de misturar bem as amostras, adicione 40 microlitros de proteinase K aos tubos. Após uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente, adicione 200 microlitros de tampão de ligação a ambos os tubos.
Misture imediatamente as amostras com um misturador de vórtices durante quatro minutos. Em seguida, coloque os tubos em banho-maria a 70 graus Celsius por 10 minutos. até que a solução fique clara.
Em seguida, transfira a solução límpida com precipitado floculante. em uma coluna de adsorção de três centímetros de comprimento embalada com matriz de silício. Centrifugar a coluna a 8.000 G durante 30 segundos.
Em seguida, descarte o líquido residual no tubo de coleta e coloque a coluna de volta no tubo de coleta. Agora adicione 500 microlitros do tampão de remoção do inibidor na coluna e centrifuja a 13.400 G por 30 segundos. Depois de descartar o líquido residual, adicione 700 microlitros do tampão de lavagem à coluna e centrífugo novamente.
Depois de descartar o líquido residual, coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta vazio. Centrifugar a coluna a 14, 500 G durante dois minutos para remover o máximo possível de tampão de lavagem. Agora retire a coluna e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo.
Adicione 100 microlitros de tampão de eluição à parte média da membrana de adsorção. Centrifugar a coluna a 13, 400 G durante um minuto após cinco minutos de incubação à temperatura ambiente. Transfira a solução obtida no tubo de coleta de volta para a coluna de adsorção antes de centrifugar novamente.
Armazenar o DNA da diatomácea eluída a dois a oito graus Celsius para uso futuro. A eletroforese em gel de agarose mostrou bandas de DNA de diatomáceas entre 250 e 500 BP em amostras de água e tecidos após amplificação por PCR.
