Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82060341,81560304) e pelo Projeto de Pesquisa Científica da Plataforma de Inovação Acadêmica da Província de Hainan (YSPTZX202134).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Hainan Medical University. As amostras de tecido utilizadas neste estudo não são consideradas estudos envolvendo seres humanos. Esses espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico patológico forense, e o restante foi usado para a extração de DNA de diatomáceas neste experimento. Os pesquisadores não podem identificar prontamente os indivíduos para obter o consentimento informado das partes interessadas relevantes.
OBS: Para garantir a aplicabilidade geral do método de pesquisa relatado neste experimento, este experimento seguiu basicamente as instruções de operação do kit utilizado, sendo que apenas algumas etapas foram modificadas. As amostras de água utilizadas neste experimento foram retiradas aleatoriamente de lagoas próximas ao laboratório (Figura 1A Suplementar). Neste experimento, o tecido pulmonar do corpo afogado foi confirmado como tecido de pesquisa para demonstrar o protocolo de extração (Figura 1B Suplementar). Na prática forense, às vezes também é necessário usar outros órgãos e tecidos de corpos afogados (como fígado, baço, rim, medula óssea, etc.) para extrair o DNA das diatomáceas, o que requer pequenas melhorias correspondentes a este método experimental, que serão explicadas na seção correspondente do experimento. As amostras de tecido pulmonar utilizadas neste experimento foram provenientes de cadáveres claramente afogados em casos forenses. Testes morfológicos têm sido realizados para comprovar que o tecido pulmonar contém diatomáceas (Figura 2 Suplementar).
1. Pré-tratamento das amostras
<ol><li>Pré-tratamento de amostras de água<ol><li>Levar 10 mL de amostra de água para o tubo da centrífuga e centrifugar a 13.400 x g por 5 min. Descarte cuidadosamente 9,8 mL de sobrenadante com uma pistola de pipeta e transfira cerca de 200 μL de amostra de água de diatomácea enriquecida restante no fundo para um tubo de centrífuga de 2 mL. NOTA: O pré-experimento pode ser realizado primeiro, e a quantidade inicial pode ser aumentada se uma amostra de água de 10 mL não for suficiente para o enriquecimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-tratamento de amostras de tecido<ol><li>Tome 0,5 g do tecido da margem pulmonar do corpo afogado, pique totalmente ou triture o tecido pulmonar até que fique lamacento. Prevenir a contaminação de diatomáceas exógenas é o cerne desta etapa. Corte o tecido em pedaços repetidamente usando uma tesoura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extração de DNA
NOTA: Todas as etapas de centrifugação são concluídas à temperatura ambiente. Usando uma centrífuga de mesa com uma força centrífuga de 14.500 x g; um banho-maria (ou banho metálico) pré-aquecido a 70 °C precisa ser preparado antes do início do experimento. Todas as etapas devem seguir rigorosamente os princípios de operação asséptica.
<ol><li>Montagem de amostras de água e tecidos NOTA: A amostra de água e o método de extração de DNA de diatomáceas de tecido são os mesmos.<ol><li>Adicionar esferas de vidro a um tubo de centrifugação de 2 mL contendo a amostra de água pré-tratada. Inverta 10x-15x para misturar bem. As contas de vidro adicionadas são compostas de contas de vidro grandes e pequenas misturadas em uma proporção de massa de 1:1. O diâmetro das contas de vidro grandes é de 1,5-2,0 mm e das contas de vidro pequenas é de 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Tome 0,5 g de tecido finamente picado, adicione contas de vidro a um tubo de centrífuga de 2 mL contendo o tecido, conforme descrito acima. Inverta 10x-15x para misturar.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicionar 40 μL de proteinase K (20 mg/mL) aos tubos. Coloque em temperatura ambiente por 15 min, durante esse período, inverta e misture 10x a cada 3 min. NOTA: Se o tecido não for totalmente digerido, a quantidade de proteinase K pode ser adequadamente aumentada até que a solução se torne clara.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de tampão de ligação aos tubos da centrífuga, imediatamente vórtice, e misturar durante 4 min (frequência de mistura de oscilação: 3000 rpm). NOTA: Nesta etapa, a intensidade e o tempo de agitação devem ser rigorosamente controlados para garantir intensidade e tempo de mistura suficientes.</li>
	<li>Coloque os tubos de centrifugação em banho-maria a 70 °C por 10 minutos e a solução fica límpida.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de isopropanol aos tubos da centrífuga, vórtice e misturar por 15 s, precipitação floculenta pode aparecer neste momento. NOTA: É muito importante misturar bem com a força adequada nas etapas de operação acima, mas o tremor vigoroso deve ser evitado para evitar o cisalhamento do DNA.</li>
	<li>Colocar a solução obtida na etapa anterior juntamente com o precipitado floculante na coluna de adsorção (a coluna de adsorção é colocada no tubo de coleta). O comprimento da coluna de adsorção é de 3,0 cm, o diâmetro é de 1,0 cm e a matriz de adsorção é a membrana da matriz de silício.</li>
	<li>Centrifugar a 8.000 x g por 30 s, descartar o líquido residual no tubo de coleta e colocar a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de remoção do inibidor à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.</li>
	<li>Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta. NOTA: Adicione a quantidade especificada de etanol absoluto ao frasco tampão de lavagem antes da primeira utilização.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão de lavagem à coluna de adsorção. Centrifugar a 13.400 x g por 30 s e descartar o líquido residual no tubo de coleta.</li>
	<li>Coloque a coluna de adsorção de volta no tubo de coleta vazio. Centrifugar a 14.500 x g por 2 min e remover o tampão de lavagem o máximo possível, para evitar que o etanol residual no tampão de lavagem iniba as reações a jusante.</li>
	<li>Retire a coluna de adsorção e coloque-a em um tubo de centrífuga limpo. Adicionar 100 μL de tampão de eluição à parte média da membrana de adsorção.</li>
	<li>Colocar a coluna de adsorção à temperatura ambiente durante 3-5 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Adicionar novamente a solução obtida na etapa anterior à coluna de adsorção centrífuga. Colocar a coluna de adsorção centrífuga à temperatura ambiente durante 2 minutos e centrifugar a 13.400 x g durante 1 min. NOTA: O tampão de eluição deve ser pré-aquecido em banho-maria a 70 °C durante cerca de 10 minutos. O volume de eluição não deve ser inferior a 50 μL; caso contrário, o rendimento de DNA será reduzido.</li>
	<li>Armazenar o DNA da diatomácea extraído a 2-8 °C para uso futuro. Se a solução de ADN for conservada durante muito tempo, armazene-a a -20 °C.</li>
</ol>3. Teste PCR
NOTA: Como o conteúdo de diatomáceas em amostras forenses é frequentemente baixo, os extratos de amostras de tecido dos corpos afogados também podem conter diferentes graus de tecido e órgãos (como os pulmões neste experimento) com seu próprio DNA. Portanto, a detecção direta de DNA total em extratos de DNA não reflete a situação da extração de DNA de diatomáceas. Neste experimento, primers diatomáceas específicos foram selecionados, e produtos de PCR foram usados para avaliar a extração de DNA de diatomáceas no extrato. Os produtos podem ser observados e analisados por eletroforese em gel de agarose e também podem ser analisados por curva quantitativa de fusão por PCR fluorescente em tempo real, que apresenta maior sensibilidade.
<ol><li>Adicione 2 μL do DNA extraído de amostras de água e tecidos como modelo. Escolha um dos dois métodos a seguir para inspeção.</li>
	<li>Teste PCR convencional<ol><li>Use primers22 que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S. Para obter detalhes, consulte a Tabela 1.</li>
		<li>Estabelecer o sistema de reação de PCR e as condições de amplificação de acordo com as características dos primers. Para obter detalhes, consulte a Tabela 2.</li>
		<li>Executar os produtos de amplificação de PCR em gel de agarose a 2%. Observe e analise as imagens com um imageador em gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Teste de PCR quantitativo fluorescente<ol><li>Use os primers acima que podem amplificar especificamente fragmentos de rDNA de diatomácea 18S para preparar um sistema de reação quantitativa de PCR fluorescente em tempo real. Para obter detalhes, consulte a Tabela 3.</li>
		<li>Realizar a amplificação por PCR e analisar a curva de amplificação obtida e os valores de Ct. Ao mesmo tempo, defina um programa, derreta as fitas duplas dos produtos amplificados em fitas simples gradualmente através da tecnologia de curva de fusão quantitativa fluorescente por PCR e, em seguida, analise as curvas de fusão obtidas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Extração econômica de DNA de diatomáceas usando um kit modificado

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. 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The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. 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J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. 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Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

As células das diatomáceas são protegidas por paredes celulares siliciosas duras17, e essa estrutura deve ser destruída para extrair o DNA das diatomáceas. Os kits comuns não destroem facilmente a casca siliciosa das diatomáceas; portanto, é difícil extrair com sucesso o DNA das diatomáceas21. Nosso laboratório aprimorou o kit de extração de DNA sanguíneo mais comumente usado, adicionando esferas de vidro de diferentes diâmetros e diferentes proporções de m...

Na prática forense, determinar se um cadáver encontrado na água se afogou ou foi jogado na água após a morte é essencial para a resolução adequada do caso1. É também uma das questões difíceis que precisam ser resolvidas urgentemente na prática forense2. Diatomáceas são abundantes no ambiente natural (especialmente na água)3,4. No processo de afogamento, devido à hipóxia e resposta ao estresse, as pessoas terão movimentos respiratórios intensos e inalarão uma grande quantidade de líquido de afogamento. Assim, as diatomáceas presentes na água entram no pulmão com o líquido de afogamento, e algumas diatomáceas podem entrar na circulação sanguínea pela barreira alvéolo-capilar e se espalhar para órgãos internos com o fluxo sanguíneo 5,6. A detecção de diatomáceas em tecidos internos e órgãos como pulmão, fígado e medula óssea é uma forte evidência de afogamento antes da morte 7,8. Atualmente, o teste forense de diatomáceas baseia-se principalmente em métodos de testes morfológicos. Após uma série de pré-digestão do tecido, as estimativas qualitativas e quantitativas morfológicas das diatomáceas não digeridas são realizadas ao microscópio. Durante este período, é necessário utilizar reagentes perigosos e prejudiciais ao ambiente, como o ácido nítrico. Esse processo é demorado e exige dos pesquisadores sólidos conhecimentos taxonômicos e ampla experiência. Tudo isso traz alguns desafios para a equipe forense9. A tecnologia de teste de DNA de diatomáceas é uma nova tecnologia para testes de diatomáceas desenvolvida nos últimos anos 10,11,12. Esta tecnologia realiza a identificação de espécies de diatomáceas através da análise da composição de sequências específicas de DNA de diatomáceas13,14. A tecnologia de PCR e a tecnologia de sequenciamento são métodos técnicos comumente usados, mas sua base é a extração bem-sucedida de DNA de diatomáceas. No entanto, as diatomáceas têm uma estrutura especial diferente de outros organismos, tornando suas técnicas de extração de DNA também diferentes.
A parede celular das diatomáceas apresenta alto grau de silicificação, e seu principal componente é o dióxido de silício 15,16,17. A parede celular siliciosa é muito dura, e deve ser destruída antes de extrair o DNA. Kits comuns de extração de DNA são muitas vezes difíceis de usar diretamente para a extração de DNA de diatomáceas, porque não podem destruir a casca siliciosa das diatomáceas18. Portanto, destruir a casca siliciosa das diatomáceas é um dos principais problemas técnicos a serem resolvidos na extração do DNA das diatomáceas.
Ao mesmo tempo, como o número de diatomáceas contidas em amostras de pesquisa forense, sejam amostras de água ou órgãos e tecidos de corpos afogados, é muitas vezes limitado, é necessário enriquecer diatomáceas. A essência do enriquecimento é a separação das substâncias. Ao tentar reunir diatomáceas, minimize o conteúdo de outros componentes do material (componentes interferentes). Em trabalhos forenses, os laboratórios frequentemente usam métodos de centrifugação ou enriquecimento por filtração de membrana para separar as células das diatomáceas19. No entanto, como o equipamento de bombeamento a vácuo não é amplamente utilizado, o método de enriquecimento de membrana não é frequentemente usado em laboratórios forenses primários comuns. Assim, o método de centrifugação ainda é comumente enriquecido por diatomáceas em laboratóriosforenses 20.
A extração de DNA de diatomáceas é atualmente usada principalmente na prática forense, e há limitações significativas para sua aplicação. Atualmente, existem poucos kits de extração de DNA de diatomáceas utilizados em ciências forenses no mercado e geralmente são caros21. Este artigo fornece um método melhorado de extração de DNA de diatomáceas, tornando a extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômica. Isso aumenta a aplicação de testes subsequentes de biologia molecular de diatomáceas e pode resolver melhor problemas relacionados ao afogamento em medicina legal por meio de testes de diatomáceas. Este método quebra as paredes celulares siliciosas das diatomáceas adicionando contas de vidro e definindo um momento apropriado para o vórtice. Desta forma, a proteinase K e a solução de ligação lisam rapidamente as células e inativam várias enzimas nas células. O DNA genômico é absorvido na membrana da matriz na coluna de adsorção e finalmente eluído pelo tampão de eluição. Esse kit de extração de genes de sangue total melhorado melhora o efeito de extração de DNA de diatomáceas do kit de sangue em materiais de exame forense, reduz o custo da extração de DNA de diatomáceas na prática forense e pode ser melhor aplicado à pesquisa forense de base.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

O teste de diatomáceas é um meio auxiliar essencial na prática forense para determinar se o cadáver se afogou na água e inferir o local do afogamento. O teste de diatomáceas também é um importante conteúdo de pesquisa no campo do meio ambiente e do plâncton. A tecnologia de teste de biologia molecular de diatomáceas, que se concentra no DNA de diatomáceas como objeto de pesquisa primário, é um novo método de teste de diatomáceas. A extração de DNA de diatomáceas é a base do teste molecular de diatomáceas. Atualmente, os kits comumente usados para extração de DNA de diatomáceas são caros, o que aumenta o custo de realização de pesquisas relacionadas. Nosso laboratório melhorou o kit geral de extração rápida de DNA genômico de sangue total e obteve um efeito satisfatório de extração de DNA de diatomáceas, fornecendo assim uma solução alternativa econômica e acessível de extração de DNA baseada em esferas de vidro para pesquisas relacionadas. O DNA da diatomácea extraído usando este protocolo poderia satisfazer muitas aplicações a jusante, tais como PCR e sequenciamento.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

Autor em destaque: Teste de diatomáceas para exame forense de afogamento 

Extração de DNA de Diatomáceas de Amostras de Água e Tecidos

Our research mainly focus on the topic of drowning. We wanted to answer the question of whether the body found in the water died from drowning, as well to answer another question of where the person fell into the water. That means to know the location of the drowning.Compared with other technologies, we provide a simple, convenient, and economical diatom DNA extraction protocol that we can use better in forensic research, especially in basic forensic practice. Our laboratory will further focus on the drowning related problems based on the pattern in the water, such as reason of death, post mortem interval and so on. What's more, we also carry on the research through the forensic entomology and a some special phenomenons in the tropical forensic medicines.

Uma vez que a solução de DNA extraída pelo método de extração de DNA atualmente utilizado contém todos os componentes de DNA de diferentes fontes na amostra, o DNA obtido por este protocolo não foi exceção. Assim, a solução de DNA não era apenas uma solução de DNA genômico de diatomáceas. Os primers capazes de amplificar especificamente fragmentos de rDNA da diatomácea 18S foram selecionados por meio de consulta à literatura22,23,24....

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Este artigo descreve um protocolo para extração de DNA de diatomáceas usando um kit de extração de DNA comum modificado.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Nossa pesquisa se concentra principalmente no tema do afogamento. Queríamos responder à pergunta se o corpo encontrado na água morreu por afogamento, bem como responder a outra pergunta de onde a pessoa caiu na água. Isso significa saber o local do afogamento.Em comparação com outras tecnologias, fornecemos um protocolo de extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômico que podemos usar melhor em pesquisas forenses, especialmente na prática forense básica. Nosso laboratório se concentrará ainda mais nos problemas relacionados ao afogamento com base no padrão na água, como motivo da morte, intervalo post mortem e assim por diante. Além disso, também realizamos a pesquisa através da entomologia forense e alguns fenômenos especiais nas medicinas forenses tropicais.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.3K visualizações.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). Nossa pesquisa se concentra principalmente no tema do afogamento. Queríamos responder à pergunta se o corpo encontrado na água morreu por afogamento, bem como responder a outra pergunta de onde a pessoa caiu na água. Isso significa saber o local do afogamento.Em comparação com outras tecnologias, fornecemos um protocolo de extração de DNA de diatomáceas simples, conveniente e econômico que podemos usar melhor em pesquisas forenses, especialmente na prática forense básica. N...

Vídeo: Autor em destaque: Teste de diatomáceas para exame forense de afogamento 

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

Medicina

Diatom DNA Extraction from Water Sample and Human Lung Tissue Using a Modified DNA Extraction Kit

To begin, take 10 milliliters of the diatom water sample in a centrifuge tube. Centrifuge the tube at 13, 400 G for five minutes. With a pipette gun, carefully discard 9.8 milliliters of the supernatant.Then transfer 200 microliters of the enriched diatom water sample into a two-milliliter centrifuge tube. Next, take 0.5 grams of lung margin tissue from a drowned human body. With scissors, cut the lung tissue until it becomes muddy.For DNA extraction off both diatom and lung samples, first add glass beads to both samples. After mixing the samples well, add 40 microliters of proteinase K to the tubes. After a 15-minute incubation at room temperature, add 200 microliters of binding buffer to both tubes.Immediately mix the samples with a vortex mixer for four minutes. Then place the tubes in a water bath at 70 degrees Celsius for 10 minutes. until the solution becomes clear.Next, transfer the clear solution with flocculent precipitate. into a three-centimeter long adsorption column packed with silicon matrix. Centrifuge the column at 8, 000 G for 30 seconds.Then discard the waste liquid in the collection tube and put the column back into the collection tube. Now add 500 microliters of the inhibitor removal buffer into the column and centrifuge at 13, 400 G for 30 seconds. After discarding the waste liquid, add 700 microliters of the washing buffer to the column and centrifuge again.After discarding the waste liquid, place the adsorption column back into the empty collection tube. Centrifuge the column at 14, 500 G for two minutes to remove as much wash buffer as possible. Now take the column out and place it in a clean centrifuge tube.Add 100 microliters of elution buffer to the middle part of the adsorption membrane. Centrifuge the column at 13, 400 G for one minute after a five-minute incubation at room temperature. Transfer the solution obtained in the collection tube back into the adsorption column before centrifuging again.Store the eluted diatom DNA at two to eight degrees Celsius for future use. Agarose gel electrophoresis showed diatom DNA bands between 250 to 500 BP in both water samples and tissues after PCR amplification.