Para começar, remova o omento humano recém-excisado do recipiente de coleta dentro de uma capela de fluxo laminar. Mergulhe o omento em PBS para lavar suavemente qualquer sangue residual ou detritos. Usando bisturi e pinças, corte o tecido em pedaços.
Coloque os pedaços de omento em poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços. Em seguida, encha os poços com 500 microlitros de meios de cultura de omento. Adicionar 10 mililitros de PBS estéril a um frasco de cultura contendo 75% de células humanas confluentes de câncer de ovário mCherry positivas.
Agite suavemente o balão para lavar as células. Retire o PBS e adicione três mililitros de EDTA de tripsina a 0,05%. Agitar suavemente o frasco de cultura novamente para distribuir uniformemente o EDTA de tripsina nas células anexadas.
Em seguida, coloque o balão numa incubadora durante cinco minutos a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono. Depois disso, retire o frasco da incubadora. Agora toque no frasco de cultura para desprender completamente as células.
Em seguida, adicione três mililitros de omento para neutralizar a tripsina. Pipetar a suspensão da célula várias vezes para misturá-la bem. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros.
Centrifugar a suspensão a 1.200 G durante cinco minutos a 24 graus Celsius. Agora pipetar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em seis mililitros de meio de cultura de omento fresco. Tome 10 microlitros da suspensão celular para contar as células usando um contador de células.
Diluir a suspensão celular com meios de cultura frescos até à densidade requerida. Com uma seringa de um mililitro, retire a suspensão de células cancerígenas. Fixe uma agulha de calibre 26 à seringa.
Agora use um par de pinças cirúrgicas pequenas para pegar um pedaço do omento cortado e coloque a peça de omento em um prato estéril de trabalho separado. Em seguida, injete cerca de 100 microlitros da suspensão de células cancerígenas no tecido. Alternativamente, misturar volumes iguais de matriz de membrana basal descongelada com cultura de omento.
Coloque a mistura no gelo até a injeção. Após imergir os pedaços de omento na mistura matricial nos poços da placa de cultura, incubar a placa por 20 minutos. Depois disso, retire a placa da incubadora.
Uma vez que a mistura tenha solidificado, injete os pedaços de omento com as células cancerosas. Confirme a injeção bem-sucedida das células cancerosas usando imagens fluorescentes. Uma faixa de sinal fluorescente pode ser vista nos locais de injeção como confirmação.
Para facilitar a co-cultura do omento e células cancerosas, adicione 500 a 200 microlitros de meios frescos a cada 48 a 72 horas. Finalmente, usando um microscópio fluorescente, monitorar o crescimento de tumores de câncer de ovário. O crescimento do tumor pode ser visível em duas semanas.
As células cancerosas do ovário foram integradas com sucesso nos pedaços de omento até o dia 14. As células cancerosas inicialmente se espalharam pela superfície do omento na primeira semana. Com o tempo, as células se reuniram para formar tumores.
A carga tumoral foi confirmada pela mudança de cor do omento médio, que passou de vermelho para amarelo.
