Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

Para começar, prepare uma placa de agarose 1,8% com meio HEPES Buffered E3 ou E3. Enquanto estiver trabalhando sob um microscópio de dissecção, coloque de seis a 10 larvas anestesiadas em uma fileira na placa de agarose. Coloque um pino de inseto na cabeça de cada larva. Em seguida, remova o E3 restante da placa usando um tecido.

Usando outro pino de inseto, isole o intestino de uma larva sem perturbar quaisquer outros órgãos. Garantir a remoção adequada da gema. Uma vez isolado, inspecione o intestino e remova todo o material não intestinal, como pele, gordura ou fígado.

Use uma pinça para coletar o intestino e transferi-lo para PBS contendo 10% FCS em um tubo de microcentrífuga colocado no gelo. Imediatamente após a dissecção de todos os intestinos, centrifugar o tubo de microcentrífuga a 13.800 g por 30 segundos. Retire o sobrenadante, deixando cerca de 100 microlitros no tubo para evitar que os intestinos sequem.

Adicione 500 microlitros de solução de papaína aos intestinos no tubo. Ativar a papaína adicionando 2,5 microlitros de cisteína molar. Em seguida, incube o tubo contendo os intestinos em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Pipetar o conteúdo para cima e para baixo na metade após cinco minutos para estimular a digestão enzimática do tecido. Transfira as células dissociadas para um tubo de classificação celular ativado por fluorescência, ou FACS, através de um filtro de células pré-acoplado de 35 mícrons. Lave o filtro várias vezes adicionando 0,5 mililitros de PBS contendo 10%FCS a um volume total de lavagem de dois mililitros.

Centrifugar o filtrado recolhido a 700 g durante cinco minutos a 4 graus Celsius e remover o sobrenadante. Adicione um micrograma por mililitro DAPI a 300 microlitros de PBS contendo 10%FCS. Adicione esta mistura ao pellet e ressuspenda para rotular as células mortas.

Em seguida, incubar por cinco minutos no gelo para permitir sua exclusão durante a análise subsequente do FACS.