Para começar, pipetar 3,75 mililitros de soro reduzido em um tubo marcado A e diluir o meio com 105 microlitros do reagente de transfecção. Vórtice o conteúdo do tubo para misturar bem. Em seguida, adicione 3,75 mililitros do meio de soro reduzido em um tubo marcado B.Dilua os plasmídeos de expressão com 90 microlitros de reagente potencializador.
Agora adicione o conteúdo do tubo A ao tubo B e pipetar a solução para misturar bem antes da incubação. Remova cuidadosamente 10 mililitros de meio de cultura celular de uma placa ecológica Phoenix preparada. Em seguida, adicione todo o volume da mistura de transfecção ao prato gota a gota.
Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora. Coloque o meio de colheita viral MTCM em banho-maria a 37 graus Celsius para pré-aquecê-lo. Agora incline a placa ecológica Phoenix e pipete o meio de cultura.
Em seguida, pipete 30 mililitros do meio de colheita viral pré-aquecido lentamente na placa inclinada. Coloque as células de volta na incubadora. Após 48 horas da transfecção, colher o sobrenadante viral.
Filtre-o através de filtros PVDF de 0,45 micrômetros. Com a parte de trás de uma seringa estéril, esmague baços murinos isolados através de um filtro de células de 70 a 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, lave o filtro com cinco mililitros de tampão de isolamento de células T.
Após levar o volume final das células para 50 mililitros, conte as células com o hemocitômetro. Pellet as células por centrifugação durante 10 minutos a 450 G a quatro graus Celsius ou à temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet de células contendo os esplenócitos com o kit de isolamento de células T recomendado.
Em seguida, isole as células T CD3 positivas usando seleção negativa. Transfira o isolado separado magneticamente para um tubo cônico de 15 mililitros. Verifique a contagem de células novamente.
Centrifugar as células T isoladas durante 10 minutos a 450 G a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em meio de ativação MTCM. Agora adicione esferas magnéticas revestidas de anticorpos e interleucina-2 à suspensão celular para ativar as células T.
Incubar as células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia zero, pré-revestir placas estéreis de 24 poços não tratadas com 0,5 mililitros de reagente intensificador de transdução de fibronectina humana. Guarde as placas a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, retire o reagente de transdução dos poços. Bloquear os poços com igual volume de BSA filtrado estéril suplementado PBS por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, remova o PBS BSA e lave os poços com PBS de 0,5 a um mililitro.
Em seguida, adicione um mililitro do retrovírus puro a cada poço pré-revestido. Centrifugar a placa a 2.000 G durante 90 minutos a 32 graus Celsius. Em seguida, adicione um mililitro das células T ativadas a cada poço carregado viralmente.
Centrifugar as placas novamente a 450 G por 10 minutos a 32 graus Celsius. Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No quinto dia, ressuspender as células para dissociar as células T ativadas das esferas revestidas com anticorpos.
Coloque a suspensão da célula em um ímã por 30 segundos. Em seguida, transfira a suspensão para um recipiente de cultura ex vivo. Colocar os vasos em uma incubadora a 37 graus Celsius antes da análise por citometria de fluxo.
O uso do kit de isolamento de células T produziu pureza de células T inferior a 98% antes da transdução. Taxas de expressão reprodutíveis de CAR de 65 a 75% foram alcançadas. Culturas ex vivo com interleucinas-7 e 15 levaram a uma pós-ativação de 15 vezes até o dia 10 a partir de um único baço.
A cultura das células T com as interleucinas levou a frequências comparáveis de linfócitos T CD8 positivos e CD4 positivos. Após 10 dias de cultivo ex vivo, observou-se que as populações de memória de células-tronco estavam preservadas.
