Para começar, adicione 0,25% de solução de tripsina-EDTA às células HeLa e incube a 37 graus Celsius por dois a três minutos. Dissociar suavemente as células por pipetagem e semeá-las em novas placas na proporção de um para quatro para a passagem celular. Para transfectar o plasmídeo em células HeLa, misturar um micrograma do plasmídeo sgRNA PX458 validado, com 50 microlitros de meio de soro reduzido em tubo A.In tubo B, misturar suavemente dois microlitros do reagente de transfecção e 50 microlitros de meio de soro reduzido e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, combine o conteúdo dos tubos A e B e incube em temperatura ambiente por mais cinco minutos. Adicione a mistura à placa de 12 poços e incube as células a 37 graus Celsius por seis horas. No final da incubação, substitua o meio por meio DMEM fresco.
Após 24 ou 48 horas, avaliar a eficiência da transfecção examinando as células HeLa em microscópio de fluorescência. Dissociar totalmente as células HeLa transfectadas usando EDTA de 0,25% de tripsina e incubar a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Em seguida, conte as células usando uma câmara de Neubauer ou um contador de células automatizado.
Agrupar as células em três placas separadas de 96 poços para cada população transfectada seguindo métodos de diluição seriada. Retorne as células a uma incubadora umidificada por uma a duas semanas. Para triagem baseada em fenótipo e validação do CENP-E Knockout, dissociar e expandir as células em placas de 24 ou 12 poços por cinco a sete dias.
Triagem das células mutantes com menores diâmetros de colônia usando um microscópio invertido com lentes objetivas de 10 vezes e 20 vezes de aumento. Em seguida, colete as células para extração de DNA empregando o Kit de Extração de DNA Genômico Animal de Coluna seguindo as instruções do fabricante e configure as reações em cadeia da polimerase. Ligate o DNA alvo no vetor pMD18-T conforme orientado pelos protocolos do fabricante.
Transfectar o plasmídeo ligado em células DH5-Alpha competentes, e prosseguir com a cultura para seleção de clones. Para identificar os tipos de Nocaute CENP-E, isole o DNA plasmidial com a ajuda de um Kit de Extração de Plasmídeos seguindo as orientações do fabricante. Em seguida, realize o sequenciamento de Sanger para o DNA plasmidial de cada colônia usando iniciadores M13 forward e reverse.
Semear o tipo selvagem e células HeLa mutantes CENP-E em tampa de vidro de 12 milímetros desliza em uma placa de 24 poços. Remova o meio DMEM completo e fixe as células usando uma solução de paraformaldeído e PBS a 4% à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, corar os núcleos com DAPI à temperatura ambiente por cinco minutos.
Observar e validar as células mutantes do CENP-E com base no fenótipo de alinhamento cromossômico utilizando um microscópio de fluorescência. A triagem fenotípica das colônias mostrou que as células Knockout do CENP-E apresentaram maior desalinhamento cromossômico em relação ao grupo controle.
