Coloração por imunofluorescência e microscopia confocal de alta resolução de células HeLa knockout CENP-E mediadas por CRISPR/Cas9

Para começar, pegue um prato de células HeLa mutantes do tipo selvagem e CENP-E crescendo em uma tampa. Fixar as células com paraformaldeído a 4% e solução fixadora PBS à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, mergulhe no PBS por duas rodadas de cinco minutos cada.

Em seguida, permeabilizar as células com Triton X-100 a 0,25% e PBS à temperatura ambiente por 10 minutos. Mergulhe-os no PBS por duas rodadas de cinco minutos cada. Proceder ao bloqueio das células com PBS 1%BSA com 0,1%Tween 20 à temperatura ambiente durante uma hora.

Diluir os anticorpos primários em BSA e PBST a 1% e incubar as amostras a quatro graus Celsius durante 12 horas. Descarte as soluções primárias de anticorpos. Em seguida, lave as células três vezes por cinco minutos cada com PBS.

Adicionar anticorpos secundários diluídos à célula e incubar à temperatura ambiente durante duas horas. Em seguida, descarte os anticorpos secundários. Em seguida, lave as células com PBS três vezes por cinco minutos cada.

Manchar os núcleos com DAPI à temperatura ambiente por cinco minutos. Monte as lâminas com o meio de montagem e sela-as com esmalte. Observe as imagens de fluorescência usando um microscópio confocal de varredura, equipado com uma objetiva de abertura numérica de 63 vezes e abertura numérica de 1,40, e registre-as para análise posterior.

A coloração por imunofluorescência dos grupos controle e mutante CENP-E mostrou que as intensidades de fluorescência das proteínas CENP-E foram completamente nocauteadas nas células do clone 1 mutante CENP-E e diminuíram significativamente nas células clone 3 mutantes do CENP-E. As proporções de células metafásicas com desalinhamento cromossômico aumentaram nos clones 1 e 3 em comparação com as células controle. Enquanto isso, as proporções de células metafásicas aumentaram significativamente nas células Clone 1 e Clone 3.

Além disso, a proporção de células interfásicas aumentou ligeiramente nos grupos Clone 1 e 3 após a deleção do CENP-E, em comparação com o grupo controle. As taxas de células prófases, anáfases e telófases diminuíram ligeiramente após a deleção do CENP-E, enquanto as taxas de células metafásicas aumentaram após a deleção do CENP-E.