Preparação Cromossômica e Análise Cariotípica de Células HeLa Knockout CENP-E Mediadas por CRISPR/Cas9

Para começar, pegue as culturas de células HeLa mutantes do tipo selvagem e do CENP-E e adicione 300 colchicina nanomolar antes de incubá-las por cinco horas. Em seguida, incubar as células com EDTA de tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por três minutos e coletar as células em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugar as células a 1000 G por cinco minutos à temperatura ambiente, descartar os sobrenadantes e adicionar 1,2 mililitros de solução de cloreto de potássio 0,075 molar.

Incubar as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Ao final da incubação, centrifugar as células, descartar o sobrenadante e adicionar 0,2 mililitros de solução fixadora para prefixo. Misture suavemente por um minuto, depois colete os pellets de células conforme demonstrado anteriormente e adicione 1,5 mililitros de solução fixadora à temperatura ambiente por 10 minutos.

Depois de centrifugar as células e descartar o sobrenadante, adicione 0,6 mililitros das soluções fixadoras para criar uma suspensão celular. Coloque cuidadosamente três a cinco gotículas das suspensões celulares de 35 a 40 centímetros sobre as lâminas de gelo. Secar imediatamente as lâminas com uma lâmpada de álcool e corá-las com solução de sustentação de Giemsa a 10% por sete minutos.

Enxaguar as lâminas com água corrente por dois minutos e, em seguida, examinar as amostras usando um microscópio de luz equipado com uma objetiva de abertura numérica Plan Fluor de 40 vezes maior que 0,75. A análise cariotípica revelou diminuição do número de cromossomos nas células HeLa mutantes do CENP-E em comparação com as células do tipo selvagem.