Para começar, limpe a área da bancada com etanol 70%. Em seguida, enxágue uma seringa de vidro de cinco microlitros várias vezes com clorofórmio. Lave as grades evaporadas de carbono com etanol 100% imediatamente antes de usar.
Seque as grades em um papel de filtro limpo. Enquanto isso, lave cada pinça anticapilar com 100% de clorofórmio, seguido de 100% de etanol. Prepare três gotas de 50 microlitros de tampão de cristalização no lado limpo de um Parafilm para cada grade a ser preparada.
Encha a tampa com o tampão de cristalização e limpe a superfície de uma placa de Petri não revestida de 35 milímetros com papel de lente. Polvilhe bastante pó de talco de grau científico ao redor do perímetro da placa de Petri. Mergulhe uma ponta de pipeta de 200 microlitros no óleo de rícino para pegar uma gota de tamanho médio.
Toque a gota na superfície do tampão na placa de Petri. Enxágue a seringa de vidro de cinco microlitros duas vezes com o lipídio dissolvido antes de tomar uma alíquota. Em seguida, toque suavemente a gota lipídica de 0,5 microlitro pendente na superfície do óleo de mamona, formando uma monocamada lipídica no centro.
Prepare um prato com várias gotas sequenciais de líquido. Pegue uma grade com uma pinça anticapilar para que o braço reto da pinça e o lado evaporado de carbono da grade fiquem voltados para a monocamada. Para transferir a monocamada, toque o lado evaporado de carbono da grade para a monocamada por um a dois segundos.
Toque a tampa esférica do tampão sequencialmente nas três gotas de 50 microlitros de tampão de cristalização colocadas no Parafilme. Adicione quatro microlitros de estreptavidina na tampa esférica restante do tampão na grade. Incubar a grelha à temperatura ambiente durante duas horas numa câmara de humidade.
Prepare uma gota de 300 microlitros de tampão de enxágue no lado limpo de um Parafilm. Coloque a grade na gota de 300 microlitros do tampão de enxágue para lavar a Streptavidina não ligada. Para pegar a grade, enfie o braço torcido de uma pinça anticapilar seca na gota.
Limpe a grade com papel filtro, coloque-a com o lado dourado para baixo e seque-a por 15 a 20 minutos. Depois de seco, vire a grade para que o lado dourado fique voltado para cima. Coloque as grades no evaporador de carbono para adicionar uma fina camada de carbono no lado dourado da grade.
A micrografia de uma amostra biotinilada, congelada com grades de afinidade por estreptavidina, mostrou um padrão de grade contínua no fundo. O padrão de difração na transformada furrier rápida confirmou ainda mais uma formação de rede bem-sucedida. Após a coleta dos dados do Cryo-EM, o sinal contribuído pela rede de estreptavidina pôde ser mascarado computacionalmente para produzir uma micrografia subtraída.
Os resultados da transformada rápida de furrier mostraram que o padrão de difração para estreptavidina foi removido com sucesso.
