Colheita, descelularização e digestão de pepsina de tecidos pulmonares bovinos para formação de hidrogel de matriz extracelular pulmonar decelularizada

1 Para começar, remova os tecidos pulmonares bovinos congelados2 de 80 graus Celsius 3 e deixe-os descongelar em temperatura ambiente. 4 Disseque o tecido usando bisturis estéreis e tesouras 5 para remover a traqueia e as vias aéreas cartilaginosas, 6 em seguida, minta o tecido em pedaços pequenos. 7 Lave o tecido três vezes 8 com água ultrapura 9 contendo 2% de penicilina e estreptomicina.

10 Mergulhe a amostra de tecido picado 11 em solução de iodo a 2% por um minuto, 12 em seguida, execute duas lavagens consecutivas 13 em água destilada estéril. 14 Transfira os pedaços de tecido para um tubo de 50 mililitros 15 até a marca de 15 mililitros. 16 Encha o tubo até o topo com água destilada 17 e congele-o em nitrogênio líquido por dois minutos.

18 Em seguida, transfira imediatamente o tubo para um copo 19 contendo água a 37 graus Celsius por 10 minutos. 20 Após cinco ciclos de congelamento e descongelamento, 21 incubar a amostra em 30 mililitros 22 de solução DNase por uma hora 23 a 37 graus Celsius com agitação constante. 24 Congele as amostras de matriz extracelular descelularizada úmida 25 a 80 graus Celsius por 24 horas.

26 Transfira amostras congeladas para um liofilizador 27 e opere no modo de secagem sob vácuo 28 por três a quatro dias até que estejam totalmente secas. 29 Após a liofilização, 30 moer as amostras em um pó fino 31 em um aparelho de moagem contendo gelo seco. 32 Trate os tecidos pulmonares com 1% Triton-X-100 33 por três dias sob rotação suave 34 a quatro graus Celsius, 35 trocando a solução a cada 24 horas.

36 Incubar a amostra na solução DNase 37 durante uma hora a 37 graus Celsius com agitação constante. 38 Lave o lenço com água destilada 39 por três dias sob rolamento constante, 40 reabastecendo a água a cada 24 horas. 41 Após a última lavagem, execute a liofilização e a criomoagem 42 conforme demonstrado anteriormente.

43 Digerir 15 miligramas por mililitro 44 amostras de matriz extracelular descelularizada em pó 45 em um miligrama por mililitro de solução de pepsina 46 em temperatura ambiente sob agitação constante por 48 horas. 47 Mantenha o pH da solução em dois para uma digestão eficaz. 48 Centrifugar o tecido digerido a 5 000 g durante 10 minutos 49 e retirar o sobrenadante.