Diferenciação hepática de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em culturas 2D

Para começar, cubra cada poço de uma placa de seis poços com um mililitro de matriz de membrana basal e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Remova a matriz revestida da placa e adicione células-tronco pluripotentes induzidas por humanos preparadas em meio AK02N suplementado com inibidor de ROCK 10 micromolar. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três dias.

Após três dias, no dia zero da diferenciação hepática inicial, lave as células uma vez com o meio RPMI 1640. Em seguida, para iniciar a diferenciação da endoderme, adicione RPMI B27 GlutaMAX suplementado com três a seis micromolares CHIR 99021 e 100 nanogramas por mililitro de Activina A na placa. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

No primeiro dia, substitua o meio existente por RPMI B27 GlutaMAX suplementado com 50 nanogramas por mililitro de Activin A. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No segundo dia, para induzir a diferenciação do progenitor hepático, substitua o meio existente pelo meio RPMI B27 GlutaMAX suplementado com 1% de dimetilsulfóxido e continue a incubação por até cinco dias. No sétimo dia, para iniciar a maturação dos hepatócitos, mude para o meio de maturação dos hepatócitos e incube por 20 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No dia 27, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos exibiram formas de células poligonais e núcleos arredondados, características dos hepatócitos.