Após 27 dias do início da diferenciação hepática de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, lave as células com dois mililitros de PBS por poço. Prepare a solução enzimática em tampão ADS usando os componentes fornecidos. Adicione um mililitro de solução por poço de uma placa de seis poços.
Coloque a placa a 37 graus Celsius em um agitador giratório por cerca de duas horas para separar as células da placa. Confirmar o descolamento das células ao microscópio, depois pipetar a suspensão celular para dispersar em células individuais e recolhê-las num tubo de 50 mililitros contendo o meio de maturação dos hepatócitos. Centrifugue a suspensão celular a 200G por cinco minutos a 18 graus Celsius.
E usando um aspirador, remova o sobrenadante. Para corar as mitocôndrias das células, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de maturação de hepatócitos contendo 100 TMRM nanomolar. Incube as células por 30 minutos a 37 graus Celsius, protegendo-as da luz.
Novamente, centrifugue a suspensão da célula e ressuspenda o pellet em um a cinco mililitros de tampão ADS frio contendo 2% de FBS. Após a contagem de células, alíquota de 500.000 células para um tubo de 1,5 mililitro e rotule-o como o controle de anticorpos não primários. Centrifugue a suspensão celular restante a 200G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante.
Adicione 100 microlitros de anticorpo primário diluído por um milhão de células. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro e incube no gelo por 50 minutos. Após a incubação, centrifugue a suspensão celular e lave as células duas vezes com tampão ADS frio contendo 2% FBS.
Agora adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diluído por um milhão de células ao anticorpo primário, células coradas ou não coradas, e incube por 30 minutos no gelo. Novamente, centrifugue a suspensão celular e lave as células duas vezes com tampão ADS frio contendo 2% FBS. Depois de ressuspender as células no tampão ADS, filtre-as através de um filtro de células de tampa de pressão e coloque o tubo no gelo.
