Para começar, coloque as sementes de Brassica napus DH12075 em micro-tubos. Para desengordurar as sementes, adicione água e detergente a 0,1% ao microtubo e agite por 60 segundos. Agora enxágue as sementes com água seguida de etanol 70%, cada uma por 60 segundos.
Em seguida, coloque as sementes em solução de hipoclorito de sódio a 10% e agite por 20 minutos. Após a retirada da água sanitária, lavar as sementes quatro vezes com água estéril por 60 segundos cada. Colocar as sementes em uma placa de Petri contendo o meio de germinação das sementes.
Estratificar as sementes a frio a quatro graus Celsius durante a noite antes de mover o prato para uma sala de cultivo. Após cinco dias, transferir as mudas para uma caixa de cultura contendo um meio de cultura vegetal. Inocular Ti menos agrobacterium tumefaciens C58C1 carregando um plasmídeo indutor de raiz pilosa PRIA 4B em cinco mililitros de meio LB.
Cultivar a cultura durante a noite a 28 graus Celsius até atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,9 para um. Transfira o inóculo bacteriano para a seringa. Com uma agulha de calibre 26 montada na seringa, puncione o hipocótilo de uma plântula de 18 dias de idade a cerca de um centímetro acima do meio de crescimento.
Injetar aproximadamente 50 microlitros de inóculo na ferida e coçar o tecido na superfície do hipocótilo. Retorne a planta à sala de cultivo a 21 graus Celsius por duas a quatro semanas. Em seguida, corte o calo com raízes pilosas emergidas do hipocótilo.
Coloque o calo com raízes pilosas em uma placa de Petri contendo meio de crescimento de raiz pilosa e antibióticos para suprimir o crescimento de agrobactérias. Sele o prato com fita permeável a gás antes de incubá-lo a 24 graus Celsius. Após a incubação, isole as raízes pilosas do calo e transfira as raízes individuais para um meio de crescimento de raízes pilosas.
Alternativamente, para gerar uma planta composta composta por brotos selvagens e raízes peludas transgênicas, remova as raízes nativas da planta. Em seguida, transfira a planta com raízes pilosas emergentes para uma caixa de cultura contendo meio de crescimento vegetal e antibióticos para suprimir o crescimento de agrobactérias.
