Para começar, coloque as sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 esterilizadas superficialmente em uma placa contendo meio de germinação de sementes. Após dois dias de estratificação fria, mova a placa para uma sala de cultivo fixada em 21 graus Celsius com fotoperíodo de dia longo e 50% de umidade. Transfira as mudas com uma semana de idade para uma caixa de cultura de plantas com meio de crescimento.
Cultivar a cultura de Agrobacterium tumefaciens em meio LB até atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,9 para 1. Usando uma agulha montada em uma seringa de insulina, injete aproximadamente 50 microlitros de cultura bacteriana na base do caule inflorescente primário de uma plântula de Arabidopsis com um mês de idade. Coce o tecido na superfície da haste primária com a seringa.
Após duas a quatro semanas, excique as raízes pilosas emergentes e cultive-as em uma placa de Petri com o meio de crescimento de raízes pilosas suplementado com antibióticos para suprimir o crescimento de agrobactérias. Cultive a raiz peluda a 24 graus Celsius no escuro. Após uma a duas semanas, individualize as raízes pilosas na placa com meio de crescimento de raiz pilosa e transfira linhas de raízes pilosas selecionadas para um meio fresco a cada quatro a cinco semanas.
Transfira as raízes pilosas para uma placa com um meio de regeneração para induzir a formação de calos, e cultura a 21 graus Celsius em um fotoperíodo de dia longo. Uma vez que os brotos emergem do calo, corte os brotos e transfira-os para um meio de alongamento dos brotos por duas a três semanas para promover o crescimento e alongamento. Em seguida, transfira os brotos alongados para o meio de indução radicular.
Por fim, transfira a planta enraizada para o solo para realizar a seleção transgênica. Em A. thaliana, calos amarelos foram induzidos dentro de 14 dias em todas as linhas de raízes pilosas testadas. Os primeiros primórdios dos brotos, visíveis como manchas verde-escuras, emergiram dentro de três semanas após a transferência para o meio de regeneração.
Após quatro semanas, os brotos cobriram as raízes pilosas em 90% das linhas, com alguns casos mostrando formação de raízes adventícias. No entanto, uma linha não se regenerou mesmo após três meses. Em comparação com o tipo selvagem, os regenerantes radiculares pilosos de A. thaliana exibiram um fenótipo anão com sistemas radiculares densos, folhas enrugadas e tempo de floração alterado.
