Agradecemos a Jiří Macas (Centro de Biologia CAS, České Budějovice, República Tcheca) por fornecer a cepa agrobacteriana. O Core Facility Plants Sciences da CEITEC MU é reconhecido por seu suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Juventude e Desportos da República Checa com o Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional-Projecto "SINGING PLANT" (nº. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) e o projeto INTER-COST LTC20004.

Indução e regeneração de raízes pilosas mediadas por Agrobacterium em plantas

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida sem quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Desenvolvemos um protocolo simples para transformação de raízes pilosas e posterior regeneração em B. napus e A. thaliana. Esse processo inclui a indução de raízes pilosas à base de injeção no caule do hipocótilo (B. napus) ou da inflorescência primária (A. thaliana). O método de injeção do hipocótilo com a linhagem C58C1 da agrobactéria portadora de um plasmídeo Ri também foi eficaz na família Fabaceae10,11, além dos membros de Brassicaceae apresentados neste estudo.
Uma alternativa ao método baseado em injeção é a transformação baseada em imersão que consiste na imersão do explante em uma suspensão bacteriana, seguida do co-cultivo do explante com agrobactérias. A vantagem do método injetável sobre o método de imersão é a economia de tempo pela ausência de algumas etapas do protocolo: preparo do explante, teste do tempo de co-cultivo e cultivo em meio contendo hormônio para indução de raízes pilosas. Embora ambas as abordagens sejam eficazes para a indução de raízes pilosas, maior eficiência de transformação foi observada em algumas espécies com o método baseado em injeção em comparação com o método de imersão em explante12,13. Além disso, a transformação baseada em injeção também é útil para gerar plantas compostas (raízes pilosas transgênicas e brotos selvagens). Depois de cortar as raízes originais da planta transformada, as raízes pilosas suportam o crescimento da planta, e o transgene pode ser estudado no contexto de toda a planta.
A etapa crítica da indução da raiz pilosa é a injeção do inóculo no hipocótilo, ou caule primário da inflorescência. Os hipocótilos de B. napus são quebráveis, e o corte de todo o hipocótilo pode facilmente acontecer. O mesmo pode ser observado com A. thaliana devido à finura do caule da inflorescência. Se for necessária uma comparação da eficiência de transformação de diferentes espécies/cultivares, recomendamos que uma pessoa realize todos os experimentos para evitar o erro causado pela manipulação e habilidade em injetar as plantas.
Desenvolvemos um protocolo eficaz para regeneração radicular pilosa em B. napus DH12075 e A. thaliana Col-0. Como a regeneração é um processo altamente variável, algumas modificações de protocolo podem ser aplicadas a uma espécie ou cultivar de escolha. Por exemplo, os brotos derivados de raízes pilosas podem ser eliciados por uma relação auxina/citocinina diferente (1:1) em B. oleracea14. Alternativamente, pode-se utilizar citocinina thidiazuron em substituição à BAP, como no caso das raízes pilosas de B. campestris 15.
Múltiplas inserções do T-DNA plasmidial de Ri no genoma da planta representam uma limitação potencial do sistema de transformação e regeneração de raízes pilosas. Nesses casos, nenhuma planta isenta de LT/TR do plasmídeo Ri é descoberta após análise de segregação de plântulas T1. Assim, recomendamos gerar várias linhas radiculares pilosas independentes para cada transgene.
As culturas de raízes pilosas são uma ferramenta extremamente poderosa para estudos funcionais de genes, principalmente devido ao seu rápido estabelecimento e manutenção barata (sem necessidade de hormônios nos meios de cultivo). Este protocolo abrange os métodos de indução e regeneração de raízes pilosas em B. napus e A. thaliana, que podem ser utilizados para estudar o transgene de interesse diretamente em culturas de raízes pilosas, no contexto da planta inteira utilizando plantas compostas, ou após a regeneração das plantas transgênicas.

A transformação vegetal é o gargalo de qualquer estudo genético em biologia vegetal. Uma bactéria transmitida pelo solo, Agrobacterium tumefaciens, é amplamente utilizada como um meio de entrega de genes por imersão floral ou cultura de tecidos para gerar transformantes. A. tumefaciens infecta plantas em um local de ferimento e causa tumores devido à transferência e integração de T-DNA de um plasmídeo indutor de tumor (Ti) no genoma da planta hospedeira. Cepas de A. tumefaciens projetadas com plasmídeo de Ti modificado sem o T-DNA selvagem e um vetor binário com T-DNA artificial e sítios de clonagem para inserção de um gene de interesse são comumente usadas como um eficiente sistema de transformação vegetal1. No entanto, muitas espécies-modelo e culturas são recalcitrantes ao mergulho floral ou à regeneração in vitro de plantas ou apresentam longos ciclos de crescimento, impactando a eficiência desse sistema de transformação.
Agrobacterium rhizogenes induz a formação de raízes adventícias, ou raízes pilosas, no local da lesão após infectar uma planta hospedeira. Semelhante a A. tumefaciens, A. rhizogenes transfere um T-DNA de um plasmídeo indutor de raízes (Ri) para o genoma da planta hospedeira, causando o desenvolvimento de raízes pilosas transgênicas. Esse processo é controlado principalmente pelos genes dos loci oncogênicos radiculares (rol)2,3. Usando linhagens de agrobactérias carregando tanto o plasmídeo Ri quanto um vetor binário artificial que codifica um gene de interesse, culturas de raízes pilosas têm sido usadas para produzir proteínas recombinantes, analisar a função de promotores ou genes, ou editar genomas usando Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Nosso protocolo utiliza a cepa transconjugante Ti-less A. tumefaciens C58C1 portadora do plasmídeo Ri pRiA4b7. O T-DNA do plasmídeo Ri consiste de duas regiões, DNA-T direito e esquerdo (DNA-TR e DNA-TL, respectivamente), que podem se integrar independentemente ao genoma vegetal8. Explorando esse sistema, otimizou-se o longo processo de transformação de explantes em cultivares de DH12075 Brassica napus 9. O protocolo detalhado abaixo permite a regeneração de linhagens pilosas selecionadas e a obtenção de plantas T1 portadoras do transgene de interesse e livres de genes rol em aproximadamente 1 ano. A transformação de raiz pilosa à base de injeção pode ser usada em outras espécies de Brassicaceae, como mostrado pela transformação de Arabidopsis thaliana Col-0. Enquanto o hipocótilo é usado para transformar B. napus, A. thaliana é injetado no caule primário da inflorescência.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

A transformação de raízes peludas representa uma ferramenta versátil para a biotecnologia vegetal em várias espécies. A infecção por uma cepa de Agrobacterium portadora de um plasmídeo indutor de raízes (Ri) induz a formação de raízes pilosas no local da lesão após a transferência de T-DNA do plasmídeo Ri para o genoma da planta. O protocolo descreve em detalhes o procedimento de indução da raiz pilosa à base de injeção em Brassica napus DH12075 e Arabidopsis thaliana Col-0. As raízes pilosas podem ser utilizadas para analisar um transgene de interesse ou processadas para a geração de plantas transgênicas. Meio de regeneração contendo citocinina 6-benzilaminopurina (5 mg/L) e ácido auxina 1-naftalenoacético (8 mg/L) provoca com sucesso a formação de brotos em ambas as espécies. O protocolo abrange a genotipagem e seleção de plantas regenerantes e T1 para obtenção de plantas portadoras de um transgene de interesse e livres de T-DNA do plasmídeo Ri. Um processo alternativo que leva à formação de uma planta composta também é descrito. Neste caso, as raízes pilosas são mantidas na parte aérea (em vez das raízes naturais), o que permite o estudo de um transgene em culturas de raízes pilosas no contexto de toda a planta.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Autor em destaque: Otimizando protocolos de transformação baseados em raízes peludas para maior eficiência em Brassicaceae

Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Previamente otimizamos um protocolo de indução de raízes pilosas à base de injeção em três cultivares de Brassica napus: DH12075, Topas DH4079 e Westar9. Para aplicar este protocolo de transformação à espécie-modelo A. thaliana, as hastes primárias da inflorescência de plântulas com 1 mês de idade foram injetadas com inóculo agrobacteriano. Raízes pilosas emergiram no local da injeção após 2-4 semanas. Raízes pilosas foram excisadas e cultivadas em meio sólido. A comparação do método nessas duas espécies está representada na Figura 1.
Linhas radiculares pilosas selecionadas foram transferidas para o meio de regeneração para induzir a formação da parte aérea. Em A. thaliana, calos amarelos foram induzidos dentro de 14 dias em todas as 10 linhagens de raízes pilosas testadas. Os primórdios da primeira parte aérea, visíveis como manchas verde-escuras, emergiram dentro de 3 semanas após a transferência para o meio de regeneração (Figura 2). Após 4 semanas de cultivo, a parte aérea cobriu as raízes pilosas em 9 de 10 linhas de raízes pilosas (90% de eficiência de regeneração). Em alguns casos, raízes adventícias foram eliciadas do calo (Figura 2H). Uma linhagem não se regenerou mesmo após 3 meses no meio de regeneração (a cada 4 semanas, as raízes pilosas foram transferidas para um meio fresco). Assim, a eficiência de regeneração das raízes pilosas de A. thaliana assemelha-se à eficiência de B. napus DH120759.
Os regenerantes de raízes pilosas de B. napus e A. thaliana apresentam fenótipo anão (Figura 3), característica típica das plantas derivadas de raízes pilosas2. Também foram observados sistemas radiculares densos, folhas enrugadas e mudanças no tempo de floração. Esse fenótipo chamado de raiz pilosa (ou Ri) é causado pelos genes rol do plasmídeo Ri inseridos no genoma da planta. A inserção do T-DNA de Ri e do transgene codificado em um vetor binário pode ser independente ou ligada. Assim, uma análise de segregação da progênie T1 criada pela autopolinização ajuda a identificar plantas rol-free expressando o transgene de interesse. A genotipagem das plantas T1 é realizada por PCR primers específicos para as ORFs de TL e TR e o transgene de interesse. A ausência de contaminação por agrobactérias é verificada pela ausência de produtos de PCR dos primers virC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Figura 1: Resumo do procedimento em A. thaliana e B. napus. A injeção do inóculo de Agrobacterium no caule do hipocótilo ou inflorescência primária induz o desenvolvimento de raízes pilosas. As raízes pilosas podem substituir as raízes nativas para gerar uma planta composta que será genotipada e analisada (setas azuis). Raízes pilosas cultivadas podem ser regeneradas em plantas T0, propagadas em plantas T1 e genotipadas (setas verdes). As raízes pilosas também podem ser subcultivadas para análise funcional (seta preta). Exemplos de resultados de genotipagem são apresentados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Figura 2: Regeneração de raízes pilosas em A. thaliana. (A) Cultivo de raízes pilosas 1 dia após sua transferência para placas. (B, C) Calli desenvolveu-se dentro de 2 semanas de cultura em meio de regeneração. (D, E) Os primórdios dos brotos emergiram após 3 semanas de cultura. (G, H) Os brotos são formados após 4 semanas. (H) As raízes adventícias desenvolveram-se a partir do calo. (C, F, I) Linha radicular pilosa não regenerante. As barras de escala representam 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Figura 3: Fotos representativas de plantas silvestres de B. napus e A. thaliana e regenerantes derivados de raízes peludas (plantas T0). Observe o fenótipo Ri dos regenerantes. As barras de escala representam 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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O protocolo descreve indução de raízes pilosas utilizando hastes primárias de inflorescência de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . As raízes pilosas podem ser cultivadas e usadas como explantes para regenerar plantas transgênicas.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Nossa pesquisa teve como objetivo desenvolver um protocolo para uma transformação eficiente em Brassicaceae. Usando uma transformação baseada em raízes de cabelo, melhoramos drasticamente a eficiência de transformação em Brassica napus, o que é crucial para nossa pesquisa. Nós também testamos o protocolo em espécies-modelo Arabidopsis thaliana.Otimizamos o protocolo para cultivares de primavera DH12075 em Brassica napus. O próximo desafio é otimizar o protocolo de transformação e regeneração de cultivares de inverno em Brassica napus, bem como para Brassica rapa e Brassica oleracea. Raízes pilosas podem ser facilmente propagadas, e seu rápido crescimento permite a análise imediata do gene de interesse logo após a transformação.Consequentemente, torna-se viável regenerar seletivamente linhas radiculares pilosas específicas que exibem a característica desejada. Por exemplo, uma mutação genética introduzida por CRISPR-Cas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K visualizações.  Masaryk University. Nossa pesquisa teve como objetivo desenvolver um protocolo para uma transformação eficiente em Brassicaceae. Usando uma transformação baseada em raízes de cabelo, melhoramos drasticamente a eficiência de transformação em Brassica napus, o que é crucial para nossa pesquisa. Nós também testamos o protocolo em espécies-modelo Arabidopsis thaliana.Otimizamos o protocolo para cultivares de primavera DH12075 em Brassica napus. O próximo desafio é otimizar o protocolo de transfo...

Vídeo: Autor em destaque: Otimizando protocolos de transformação baseados em raízes peludas para maior eficiência em Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Biologia

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Transformação de raízes pilosas mediada por agrobactérias em Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Métodos de Regeneração e Seleção de Plantas Regenerantes DH12075 Brassica napus e T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.