Preparação de meio líquido anaeróbio em frascos de cultura para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientais

Para começar, meça e adicione os componentes de mídia necessários a uma garrafa de 1 litro. Ajuste o pH de acordo com a cultura microbiana de interesse e misture os componentes até a homogeneidade girando o frasco. Aqueça o líquido para ferver no micro-ondas por cinco a seis minutos, abrindo o micro-ondas com frequência e girando a garrafa suavemente usando uma luva resistente ao calor.

Em seguida, conecte uma pipeta de vidro estéril de 10 mililitros a um coletor de gás nitrogênio configurado. Abra o coletor para ventilar o oxigênio e permitir que o gás nitrogênio flua. Coloque a ponta da pipeta no líquido e ajuste o fluxo de gás para que as bolhas sejam moderadamente vigorosas.

Lave o líquido com nitrogênio até que o frasco não esteja mais muito quente para tocar. Enquanto espera a garrafa esfriar, coloque 10 frascos de cultura estéreis de 100 mililitros. Quando a garrafa de mídia atingir um calor suportável, puxe a ponta da pipeta para cima no headspace da garrafa.

Adicione 0,125 gramas de bicarbonato de sódio e 0,3 gramas de sulfeto de sódio nonahydrate e aguarde até que a resazurina fique incolor. Enquanto espera que a resazurina mude de cor, prenda cânulas metálicas à configuração do coletor de gás. Ajuste o fluxo de nitrogênio para uma taxa moderada e coloque as pontas da cânula em frascos de cultura.

Uma vez que a resazurina é incolor, alíquota 50 mililitros de líquido em cada frasco de cultura. Tampe cada frasco com uma rolha de borracha de tamanho correspondente imediatamente após a remoção das cânulas. Em seguida, prenda a rolha com um selo de alumínio.

Coloque as garrafas em uma lixeira autoclavável e encha a lixeira com água da torneira até que os níveis de água correspondam aos das garrafas. Autoclave as garrafas a 121 graus Celsius por 30 minutos.