Para começar a derivar organoides cerebrais de células-tronco embrionárias H9 e obter ovos de galinha recém-fertilizados. No primeiro dia, limpe a superfície da casca do ovo com etanol 70% e deixe secar. Coloque uma atadura adesiva de papel cirúrgico em cima do ovo.
Usando uma lâmpada, deterimine a superfície mais fina da casca do ovo na ponta superior. Em seguida, com uma agulha estéril, puncione suavemente a casca do ovo para criar orifício na câmara de ar sem perturbar a camação do pintinho. Para proteger o embrião do ambiente externo, cubra o orifício da câmara de ar com um novo curativo e incube o ovo a 38 graus Celsius.
No sétimo dia, retire o curativo e limpe a superfície da casca do ovo com etanol 70%. Em seguida, coloque um curativo novo e maior cobrindo a extensão. Puncione suavemente a casca do ovo para aumentar o orifício em uma janela de enxertia de dois centímetros de diâmetro.
Usando uma pinça, remova as bordas da janela da casca do ovo e descasque o curativo para retirar o pó restante e os pedaços de casca do ovo. Usando uma ponta de calibre largo estéril, colete o organoide em 50 microlitros de PBS e transfira-o cuidadosamente para a câmara oposta à localização do embrião. Adicione uma gota de sete microlitros de gel de fósforo ao redor do organoide.
Sele a janela usando parafilme e fixe-a à casca com uma bandagem adesiva. Incubar o transplante para diferenciação cam. Após cinco dias, remova a bandagem adesiva.
Usando tesouras e pinças finas, amplie a janela para facilitar a colheita da amostra. Fixe-o com paraformaldeído a 4% durante dois minutos e recolha uma secção de 1,5 centímetro quadrado da câmara que contém o organoide. Para confirmar o sucesso do enxerto, realizar coloração de hematoxilina e eosina de cortes de tecido de 20 micrômetros de espessura com cam organoid.
A coloração de hematoxilina e eosina do tecido do enxerto indicou que os organoides continuaram a amadurecer junto aos vasos cam sem qualquer evidência de infiltração dos vasos sanguíneos.