Para começar, faça culturas de 12 dias de células-tronco pluripotentes humanas que foram submetidas à indução da crista neural. Aspire suavemente o meio C das células. Adicione 100 microlitros de PBS por centímetro quadrado de área de superfície do poço para lavar as células e, em seguida, remova o PBS.
Adicione um volume igual de solução de descolamento celular às células e incube por 30 minutos sob suplementação de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Adicione um volume igual de meio NCC na placa. Em seguida, use uma pipeta sorológica para colher a suspensão celular e transfira-a para um tubo cônico de 15 mililitros.
Gire as células a 290G por dois minutos entre 20 a 25 graus Celsius. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para pipetar 12 mililitros de meio NCC para o pellet celular.
Pipete mecanicamente a suspensão para cima e para baixo para criar uma suspensão. Em seguida, transfira a suspensão da célula para uma placa de fixação ultrabaixa. No dia 14, gire suavemente as placas de cultura de células para coletar pequenos esferoides no centro de cada poço.
Use uma micropipeta P1000 para aspirar lentamente o meio gasto da circunferência de cada poço. Realimente as células com o volume original do meio NCC. No dia 15, remova cuidadosamente o meio.
Adicione PBS aos poços para lavar os esferóides. Em seguida, remova o máximo de PBS possível, garantindo que os esferóides não sejam perturbados. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de descolamento de células por centímetro quadrado de área de superfície do poço.
Incube as células na solução por 30 minutos sob 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Com uma pipeta sorológica de 10 mililitros, adicione um volume igual de meio ENC a cada poço. Pipetar mecanicamente a solução para quebrar os esferóides restantes.
Em seguida, transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação como antes. Em seguida, ressuspenda as células em 5 a 10 mililitros de meio ENC.
Conte a concentração de células viáveis usando azul de tripano e hemocitômetro. Agora, adicione volume suficiente de meio ENC para colocar cerca de 300.000 a 400.000 células viáveis por centímetro quadrado de área de superfície e uma densidade de cerca de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, aspire as soluções dos poços.
Em seguida, adicione as células a uma placa com poços revestidos de laminina PO / FN. Alimente as células em dias alternados com 200 microlitros de meio ENC por centímetro quadrado de área de superfície do poço até os dias 30 a 40. Esferas flutuantes livres de alta qualidade com superfícies lisas foram observadas após a indução da crista neural.
Os esferoides expressaram o marcador de crista neural SOX10. Neurites foram observados entre os dias 25 a 30 durante a indução do neurônio entérico.
