O trabalho foi apoiado por doações do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora e da Fundação Sandler, March of Dimes concessão nº 1-FY18-394 e 1DP2NS116769-01, o Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH (DP2NS116769) para F.F. e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R01DK121169) para F.F., H.M. é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da Fundação Larry L. Hillblom, bolsa NIH T32-DK007418 e bolsa de pós-doutorado independente do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora.

1. Preparação de mídia
NOTA: As concentrações mencionadas em todo o protocolo são concentrações finais dos componentes do meio. Preparar todos os meios em condições estéreis numa coifa de fluxo laminar e conservar a 4 °C no escuro. Use dentro de 2 semanas.
<ol><li>Meio de manutenção hPSC: Misture o suplemento de meio de manutenção hPSC sem alimentador (20 μL / mL) com seu meio base.</li>
	<li>Meio A: Adicione a proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (600 nM) ao meio de base de diferenciação.</li>
	<li>Meio B: Adicione SB431542 (10 μM) e CHIR99021 (1,5 μM) ao meio base de diferenciação.</li>
	<li>Meio C: Adicione SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) e RA (1 μM) ao meio base de diferenciação.</li>
	<li>Meio completo da crista neural (NCC): Adicione FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) ao meio neurobasal.</li>
	<li>Meio ENC: Adicione GDNF (10 ng/mL), ácido ascórbico (100 μM), suplemento de N2 (10 μL/mL), suplemento de B27 (20 μL/mL), suplemento de L-glutamina (10 μL/mL) e MEM NEAAs (10 μL/mL) ao meio neurobasal.</li>
	<li>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1x: Diluir 500 mM de EDTA (1000x) até uma concentração final de 500 μM em PBS. NOTA: Use PBS livre de Ca2+ e Mg2+ em todo este protocolo, salvo indicação em contrário.</li>
</ol>2. Revestimento de placas de cultura
<ol><li>Placas revestidas com matriz de membrana basal: Descongele rapidamente e dilua uma alíquota congelada de 500 μL de matriz de membrana basal em 50 mL de DMEM:F12 resfriado pipetando vigorosamente usando uma pipeta sorológica de 50 mL. Revestir os alvéolos com a solução diluída de matriz da membrana basal (100 μL porcm2 de superfície do poço) e incubá-los durante a noite a 37 °C. Aspire o meio de revestimento antes de usar. Para evitar a gelatinização da matriz da membrana basal, execute esta etapa o mais rápido possível e use DMEM:F12 frio para dissolver a alíquota congelada. NOTA: A temperatura da matriz da membrana basal deve ser mantida fria durante o descongelamento (no gelo) e alíquotas (tubos no gelo) para evitar a coagulação.</li>
	<li>Placas revestidas com PO / FN / laminina: Prepare uma solução de poliornitina (PO) de 15 μg / mL em PBS diluindo um estoque de 1000x. Revestir os alvéolos com 100 μL de solução de PO/PBS porcm2 de superfície do poço e incubar as placas durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, aspire PO / PBS e cubra os poços a 100 μL por cm2 de área de superfície do poço com solução recém-feita de FN / laminina / PBS contendo 2 μg / mL de fibronectina (FN) e 2 μg / mL de laminina. As placas podem ser utilizadas após um mínimo de 2 h de incubação a 37 °C. Aspire FN / laminina / PBS antes de usar.</li>
</ol>3. Manutenção da cultura de hPSC
NOTA: Todas as etapas de incubação celular estão a 5% de CO2 e a 37 °C em uma incubadora umidificada.
<ol><li>Aspire o meio hPSC da cultura hPSC e adicione meio fresco (200 μL porcm2 de área de superfície do poço) a cada dois dias até que as colônias estejam ~ 80% confluentes.</li>
	<li>Para passar, aspire o meio hPSC e lave as células com 100 μL de PBS porcm2 de área de superfície do poço. NOTA: É importante usar PBS livre de Ca2+ e Mg2+ para lavar as células.</li>
	<li>Adicionar 500 μM de EDTA (100 μL porcm2 de área de superfície do poço). Recoloque a tampa da placa. Observe através de um microscópio invertido e monitore as células quanto ao desprendimento das bordas da colônia (2-4 min).</li>
	<li>Use uma pipeta sorológica de 5 ou 10 mL para transferir o mesmo volume de meio hPSC para cada poço e colha mecanicamente as células pipetando para cima e para baixo algumas vezes. NOTA: O tempo ideal de incubação do EDTA depende da linha iPSC. Evite pipetagem vigorosa para separar colônias, pois pode levar à dissociação excessiva da colônia e à morte celular. Ao passar para iniciar uma placa de diferenciação, incube as células com EDTA por mais 1-2 minutos.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda as células em um volume apropriado de meio hPSC e transfira para poços de uma nova placa revestida com matriz de membrana basal. NOTA: Para manutenção regular de hPSC, use uma taxa de passagem de 1:18 - 1:24 (1:18 significa transferir um terço das células dissociadas de um único poço de uma placa de 6 poços para uma placa totalmente nova). Para iniciar uma placa de diferenciação, siga uma taxa de passagem de 5:6.</li>
	<li>Incubar a 5% de CO2 e 37 °C.</li>
</ol>4. Indução da crista neural
NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1A. Comece a diferenciação NC quando as células estiverem cerca de 80% confluentes. Isso será alcançado dentro de 1-2 dias, quando as células forem passadas na proporção de 5:6 (veja acima). Inicie a diferenciação NC no dia 0 com células hPSC pluripotentes e totalmente indiferenciadas. Para uma alta eficiência, as bordas da colônia devem ter células de diferenciação mínimas. Passagem e placa hPSC para diferenciação quando as colônias são grandes ou o centro da colônia começa a engrossar/escurecer quando monitorado usando um microscópio invertido. Prestar atenção à confluência e morfologia tende a ser mais confiável do que o número de células plaqueadas, pois isso pode variar dependendo da linhagem celular e pode variar de 50.000 a 200.000 por cm2.
<ol><li>No dia 0, substitua o meio de manutenção hPSC pelo meio A contendo 1 ng/mL BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (200 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço).</li>
	<li>No dia 2, as células devem estar 100% confluentes. Aspire suavemente o meio A gasto e alimente as células com o meio B contendo 10 μM SB431542, 1,5 μM CHIR99021 (200 μL de meio por cm2 de área de superfície do poço). NOTA: À medida que as culturas crescem durante a indução NC, as células podem se desprender da monocamada subjacente. Evite o excesso de perda de células removendo suavemente o meio antigo e adicionando o meio novo na lateral do poço.</li>
	<li>No dia 4, alimente as células novamente com o meio B (200 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço).</li>
	<li>No dia 6, substitua o meio B pelo meio C contendo 10 μM de SB431542, 1,5 μM de CHIR99021 e 1 μM de ácido retinóico (400 μL de meio por cm2 de área de superfície do poço).</li>
	<li>Nos dias 8 e 10, alimente como no dia 6.</li>
</ol>5. Formação de esferóides ENC
NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1B.
<ol><li>No dia 12, aspire suavemente o meio C e lave as células com 100 μL de PBS porcm2 de área de superfície do poço. Adicione o mesmo volume de solução de descolamento celular e incube por 30 min a 5% de CO2 e 37 ° C.</li>
	<li>Dilua a solução de descolamento celular adicionando o mesmo volume de meio NCC contendo 10 ng / mL de FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL / mL de suplemento de N2, 20 μL / mL de suplemento de B27, 10 μL / mL de suplemento de L-glutamina e 10 μL / mL de MEM NEAA. Com uma pipeta serológica, colher a suspensão monocelular e adicioná-la a um tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 12 mL (para uma placa completa de 6 poços) de meio NCC e ressuspenda as células completamente pipetando mecanicamente para cima e para baixo 1-2 vezes. Transfira a suspensão da célula para uma placa de fixação ultrabaixa. NOTA: Aproximadamente 10 cm2 de células de monocamada ENC são ressuspensas em 2 mL de meio NCC e transferidas para um poço de uma placa de fixação ultrabaixa. Isso equivale a uma placa de indução NC completa de 6 poços transferida para uma placa de fixação ultrabaixa completa de 6 poços.</li>
	<li>No dia 14, gire suavemente as placas até que pequenos esferóides estejam reunidos no centro de cada poço. Usando uma micropipeta P1000 e em um movimento circular lento, aspire o meio NCC gasto ao redor da circunferência de cada poço. Tente evitar remover os esferóides flutuantes.</li>
	<li>Alimente as células com o volume original do meio NCC.</li>
</ol>6. Indução EN
NOTA: Esta etapa é representada esquematicamente na Figura 1B.
<ol><li>No dia 15, aplique a mesma técnica usada no dia 14 para remover suavemente o meio e lavar os esferoides com PBS. Remova o máximo de PBS possível, evitando os esferóides.</li>
	<li>Adicionar solução de descolamento celular (100 μL porcm2 de área de superfície do poço) e dissociar os esferóides em células únicas, incubando durante 30 min a 5% de CO2 e 37 °C.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione um volume igual de meio ENC (contendo 10 ng/mL de GDNF, 100 μM de ácido ascórbico, 10 μL/mL de suplemento de N2, 20 μL/mL de suplemento de B27, 10 μL/mL de suplemento de L-glutamina e 10 μL/mL DE MEM NEAA em meio neurobasal) a cada poço e quebre os esferoides restantes por 2-3 rodadas de pipetagem mecânica. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL. NOTA: Evite estresse excessivo e morte celular que podem ocorrer devido à pipetagem forçada ou ao uso de pipetas com abertura de ponta menor.</li>
	<li>Centrifugar as células (2 min, 290 x g, 20-25 °C) e eliminar cuidadosamente o sobrenadante. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione ~ 5-10 mL de meio ENC e ressuspenda as células completamente pipetando para cima e para baixo 1-2 vezes.</li>
	<li>Conte a concentração de células viáveis usando azul de tripano e um método de contagem de células, como um hemocitômetro. CUIDADO: O azul de tripano é suspeito de ser cancerígeno. Manuseie com cuidado, descarte adequadamente.</li>
	<li>Adicione volume suficiente de meio ENC com o objetivo de plaquear aproximadamente 300.000-400.000 células viáveis por cm2 de área de superfície a uma densidade de cerca de ~ 1.000.000 células por mL. Aspirar a solução de FN/laminina/PBS dos poços da placa. NOTA: Escolha o formato da placa de acordo com os ensaios planejados para as culturas EN, pois esta etapa marca a etapa final de replaqueamento do protocolo. Os progenitores dos neurônios entéricos podem ser congelados no dia 15. Depois de dissociar as esferas com solução de descolamento celular, ressuspenda os progenitores em aproximadamente 5 x 106 células / mL em meio de congelamento, como DMSO a 10% ou Stem-cellbanker. Quando necessário, descongele em meio ENC quente com inibidor de ROCK Y-27632 de 5 μM. Células de placa no formato de placa desejado. Substitua a mídia por ENC novo após algumas horas.</li>
	<li>Adicione suavemente as células nos poços revestidos de PO / FN / laminina. Evite que as bolhas fiquem presas sob a suspensão da célula, evitando que as células se fixem ao revestimento PO/FN/laminina, especialmente ao usar placas com tamanho de poço menor, como placas de 384 poços. Isso pode levar à morte celular.</li>
	<li>Alimente as células em dias alternados com meio ENC (200 μL porcm2 de área de superfície do poço) até o dia 30-40, após o qual reduza a frequência de alimentação (para uma ou duas vezes por semana), mas dobre o volume de alimentação (para 400 μL de meio porcm2 de área de superfície do poço). NOTA: Isso é importante, pois a remoção e adição excessivas de meios podem facilitar o desprendimento da cultura neuronal da superfície dos poços. Para evitar prospectivamente o descolamento, especialmente para culturas de longo prazo, suplemente ENC com FN (2 μg/mL) e laminina (2 μg/mL) uma vez por semana.</li>
</ol>

Derivação de neurônios entéricos de células-tronco pluripotentes humanas

<ol>
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Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método in vitro robusto para obter neurônios entéricos de hPSCs dentro de 30-40 dias (Figura 1E) e glia entérica expressando proteína glial fibrilar ácida, GFAP e SOX10 em culturas mais antigas (> dia 55) 13 , 14 , 19 , 22 . Esses neurônios e glia são induzidos pela diferenciação gradual de ...

O sistema nervoso entérico (SNE) é o maior componente do sistema nervoso periférico. O ENS contém mais de 400 milhões de neurônios localizados no trato gastrointestinal e controlam quase todas as funções do intestino1. A compreensão molecular do desenvolvimento e função do SNE e seus defeitos nas neuropatias entéricas requer acesso a uma fonte confiável e autêntica de neurônios entéricos. O acesso ao tecido primário humano é limitado e os modelos animais não conseguem recapitular os principais fenótipos da doença em muitas neuropatias entéricas. A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) provou ser extremamente benéfica no fornecimento de uma fonte ilimitada de tipos de células desejados, especialmente aquelas que são difíceis de isolar de fontes primárias 2,3,4,5,6,7. Aqui, fornecemos detalhes de um método in vitro passo a passo e robusto para obter culturas ENS de hPSCs. Essas culturas escaláveis derivadas de hPSC abrem caminhos para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças e triagem de medicamentos de alto rendimento e podem fornecer células transplantáveis para medicina regenerativa.
As linhagens de neurônios entéricos são derivadas de células da crista neural (NC) que seguem o caminho de desenvolvimento do SNE durante a embriogênese. Nos embriões, as células NC emergem ao longo das margens da placa neural dobrável. Eles proliferam, migram e dão origem a muitos tipos de células diferentes, incluindo neurônios sensoriais, células de Schwann, melanócitos, esqueleto craniofacial e neurônios entéricos e glia 8,9,10. A decisão do destino celular depende da região distinta ao longo do eixo ântero-posterior de onde emergem as células NC, ou seja, NC craniana, NC vagal, NC do tronco e NC sacral. O SNE se desenvolve a partir de células NC vagais e sacrais, com a primeira dominando a população de neurônios entéricos devido à extensa migração ao longo do intestino e colonizando o intestino11.
A derivação de células NC de PSCs geralmente envolve uma combinação de inibição dupla de SMAD e ativação da via WNT12,13. Até recentemente, todos os protocolos de indução de NC envolviam soro e outros aditivos de produtos de origem animal nas condições de cultura. Meios quimicamente indefinidos não apenas reduzem a reprodutibilidade da indução de NC, mas também desafiam os estudos de desenvolvimento mecanicista. Para superar esses desafios, Barber et al14 desenvolveram um protocolo de indução de NC usando condições de cultura quimicamente definidas e, portanto, foi vantajoso em relação a métodos alternativos que dependem de fatores de reposição de soro (por exemplo, KSR) 13 , 14 . Isso foi obtido por substituições de meios basais e otimizando um protocolo originalmente apresentado por Fattahi et al para derivar células NC entéricas de hPSCs. Este sistema aprimorado é a base do protocolo de diferenciação de hPSC que é apresentado aqui. Começa com a indução de células da crista neural entérica (ENC) em um período de 15 dias por modulação precisa da sinalização BMP, FGF, WNT e TGFβ, além do ácido retinóico (RA). Em seguida, derivamos as linhagens ENS tratando células com fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF). Todas as composições de meios são quimicamente definidas e produzem culturas neuronais entéricas robustas dentro de 30 a 40 dias.
Além do sistema de cultura de células em monocamada descrito aqui, foram desenvolvidas abordagens alternativas de indução de NC que usam corpos embrióides flutuantes 15,16. As células migratórias nessas culturas demonstraram expressar marcadores NC com um subconjunto representando o NC vagal. Co-culturas com tecido intestinal primário têm sido usadas para enriquecer precursores entéricos de NC nessas culturas. As composições de mídia nesses estudos contêm uma combinação de diferentes fatores, como fator de crescimento nervoso, NT3 e fator neurotrófico derivado do cérebro. Nesta fase, não está totalmente claro como esses fatores podem afetar as identidades de comprometimento do precursor do neurônio entérico. Para uma comparação eficiente da indução de NC entérica nas culturas baseadas em monocamada e corpo embrióide, são necessários mais dados. Dadas as diferentes configurações de cultura nessas estratégias, o uso de cada método deve ser considerado e otimizado de acordo com a aplicação específica em mente.
O protocolo aqui apresentado é reprodutível e foi testado com sucesso por nós e outros usando diferentes linhagens de hPSC (induzida e embrionária) 8,14,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

O sistema nervoso entérico humano, ENS, é uma grande rede de tipos de células gliais e neuronais com notável diversidade de neurotransmissores. O ENS controla a motilidade intestinal, a secreção enzimática e a absorção de nutrientes e interage com o sistema imunológico e o microbioma intestinal. Consequentemente, os defeitos de desenvolvimento e adquiridos do SNE são responsáveis por muitas doenças humanas e podem contribuir para os sintomas da doença de Parkinson. Limitações em sistemas de modelos animais e acesso ao tecido primário representam desafios experimentais significativos em estudos do ENS humano. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a derivação in vitro eficaz das linhagens ENS de células-tronco pluripotentes humanas, hPSC, usando condições de cultura definidas. Nosso protocolo começa com a diferenciação direcionada de hPSCs em células da crista neural entérica em 15 dias e produz diversos subtipos de neurônios entéricos funcionais em 30 dias. Essa plataforma fornece um recurso escalável para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e aplicações regenerativas.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

Autor em destaque: Cultura robusta de neurônios entéricos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas

Here we provide a method for generation of human enteric neurons from human pluripotent stem cells under fully defined conditions, and we use these cells in order to understand human enteric nervous system development and function. So I think human enteric nervous system development, physiology and pathophysiology has been a great challenge, and it's because of the rarity of the enteric nervous system cells and the transient nature of the neural crest progenitors, and difficulty in access to tissue and isolation of the tissue. This is a robust platform for generating authentic and functional human enteric neurons from HPSCs, and by overcoming longstanding technical challenges in tissue access, it provides scalable cultures of enteric nervous system components for disease modeling, drug discovery, and studying ENS developments and function.

Este protocolo fornece um método para derivar crista neural entérica e neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas ( Figura 1A-B ). A geração de neurônios de alta qualidade depende de uma etapa eficiente de indução da crista neural entérica. Isso pode ser avaliado visualmente verificando a morfologia das esferas flutuantes que devem parecer redondas com superfícies lisas com um tamanho de aproximadamente 0,1 - 0,4 mm, como vis...

A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

Aqui, fornecemos um método para geração de neurônios entéricos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas sob condições totalmente definidas, e usamos essas células para entender o desenvolvimento e a função do sistema nervoso entérico humano. Portanto, acho que o desenvolvimento, fisiologia e fisiopatologia do sistema nervoso entérico humano tem sido um grande desafio, e é por causa da raridade das células do sistema nervoso entérico e da natureza transitória dos progenitores da crista neural e dificuldade de acesso ao tecido e isolamento do tecido. Esta é uma plataforma robusta para gerar neurônios entéricos humanos autênticos e funcionais a partir de HPSCs e, ao superar desafios técnicos de longa data no acesso a tecidos, fornece culturas escaláveis de componentes do sistema nervoso entérico para modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e estudo de desenvolvimentos e função de ENS.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

845 visualizações.  University of California, San Francisco. Aqui, fornecemos um método para geração de neurônios entéricos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas sob condições totalmente definidas, e usamos essas células para entender o desenvolvimento e a função do sistema nervoso entérico humano. Portanto, acho que o desenvolvimento, fisiologia e fisiopatologia do sistema nervoso entérico humano tem sido um grande desafio, e é por causa da raridade das células do sistema nervoso entérico e da natureza transitória d...

Vídeo: Autor em destaque: Cultura robusta de neurônios entéricos humanos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.

Neurociência

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To induce neural crest formation, replace the maintenance medium of the human pluripotent stem cell culture with 200 microliters of medium A per square centimeter of the well-surface. Incubate the culture under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius for two days. Gently aspirate the medium from the well-containing 100%confluence cells then pipette about 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface area.On day four, feed the cells with 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface. Incubate the cells for two more days, then replace the medium B with 400 microliters per square centimeter of medium C.

Formação de cristas neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas para pesquisa do sistema nervoso entérico

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To begin, take 12-day cultures of human pluripotent stem cells that have been subjected to neural crest induction. Gently aspirate medium C from the cells. Add 100 microliters of PBS per square centimeter of well surface area to wash the cells, and then remove the PBS.Add an equal volume of cell detachment solution to the cells and incubate for 30 minutes under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius. Add an equal volume of NCC medium into the plate. Then, use a serological pipette to harvest the cell suspension and transfer it to a 15-milliliter conical tube.Spin the cells at 290G for two minutes between 20 to 25 degrees Celsius. Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet. Use a 10-milliliter serological pipette to pipette 12 milliliters of NCC medium to the cell pellet.Mechanically pipette the suspension up and down to create a suspension. Then, transfer the cell suspension to an ultra low attachment plate. On day 14, gently swirl the cell culture plates to gather small spheroids at the center of each well.Use a P1000 micro pipette to slowly aspirate the spent medium from the circumference of each well. Refeed the cells with the original volume of NCC medium. On day 15, carefully remove the medium.Add PBS to the wells to wash the spheroids. Then, remove as much PBS as possible, ensuring spheroids are not disturbed. Next, add 100 microliters of cell detachment solution per square centimeter of well surface area.Incubate the cells in the solution for 30 minutes under 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. With a 10-milliliter serological pipette, add an equal volume of ENC medium to each well. Mechanically pipette the solution to break any remaining spheroids.Then transfer the cells to a 50-milliliter conical tube. Discard the supernatant after centrifuging as before. Then, resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of ENC medium.Count the concentration of viable cells using trypan blue and hemocytometer. Now, add enough volume of ENC medium to plate about 300, 000 to 400, 000 viable cells per square centimeter of surface area, and a density of about 1 million cells per milliliter. Then, aspirate the solutions from the wells.Next, add the cells to a plate with PO/FN laminin coated wells. Feed cells every other day with 200 microliters of ENC medium per square centimeter of well surface area until days 30 to 40. High quality free floating spheres with smooth surfaces were observed after neural crest induction.The spheroids expressed the neural crest marker SOX10. Neurites were observed between days 25 to 30 during the enteric neuron induction.