Para começar, pegue células de 293 pés cultivadas em um prato de 10 centímetros e aspire o meio. Lave as células com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina EDTA e incube por 3-5 minutos a 37 graus Celsius para separar as células do prato.
Após a incubação, adicione nove mililitros de DMEM completo às células para neutralizar a tripsina. Pipete para cima e para baixo repetidamente para gerar uma suspensão homogênea de célula única e transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Transfira imediatamente 20 microlitros de células para um tubo de 1,7 mililitro e misture com 20 microlitros de mancha azul de tripano.
Conte as células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro. Transferir o volume adequado de células para um tubo de 50 mililitros e diluir em DMEM completo. Adicione dois mililitros de suspensão celular a cada poço de uma placa de seis poços.
Incube células a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono durante a noite. Antes da transfecção, dilua a nanoluciferase CRAF e 1433 plasmídeos de halo zeta, juntamente com um vetor vazio pCDNA3 no tampão TE. Rotule um conjunto de tubos estéreis de 1,7 mililitro.
Adicione 100 microlitros de meios de transfecção a cada tubo, juntamente com as construções de expressão. Agora adicione dois microlitros de reagente de transfecção e vortex suavemente para misturar. Gire os tubos brevemente em uma microcentrífuga e, em seguida, incube os tubos a cerca de 25 graus Celsius por 15 minutos para permitir a formação de complexos de transfecção.
Depois, adicione complexos de transfecção às células gota a gota e incube a 37 graus Celsius por 16-20 horas para expressar o halo e as proteínas nanomarcadas.
