Este projeto foi financiado em parte com fundos federais do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, sob o número de projeto ZIA BC 010329.

NOTA: Este ensaio é realizado em células de 293 pés. Uma linha epitelial bem caracterizada e facilmente transfectável derivada de células renais embrionárias humanas. Uma única placa de cultura confluente de 10 cm dessas células normalmente fornece células suficientes para semear 20 poços de placas de cultura de tecidos de 6 poços. As etapas 1 a 3 devem ser executadas usando técnica estéril em uma cabine de segurança biológica.
1. Semeadura celular (dia 1)
NOTA: Nesta etapa, as células são destacadas da(s) placa(s) de cultura de tecidos, contadas e semeadas em placas de cultura de tecidos de 6 poços para transfecção na etapa 2 (Figura 2).
<ol><li>Aspirar o meio das células da cápsula de 10 cm. Lave as células com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e aspire.</li>
	<li>Adicione 1 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 3-5 min a 37 ° C para separar as células do prato.</li>
	<li>Adicione 9 mL de meio de águia modificado completo de Dulbecco (DMEM) às células para neutralizar a tripsina e pipetar para cima e para baixo repetidamente para gerar uma suspensão homogênea de célula única.</li>
	<li>Transfira imediatamente 20 μL de células para um tubo de 1,7 mL e misture com 20 μL de corante azul de tripano. Conte as células usando um contador de células automatizado (Tabela de Materiais) ou hemocitômetro.</li>
	<li>Dilua as células para 2 x 105 células/mL em meio DMEM completo e adicione 2 mL a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços (4 x 105 células/poço). Incubar células a 37 °C e 10% de CO2 durante a noite. NOTA: Recomenda-se o uso de células de 293 pés que tenham sido passadas menos de 20x. Descobrimos anteriormente que o uso de células com maior número de passagens pode resultar em taxas BRET reduzidas e aumento da variabilidade do sinal poço a poço.</li>
</ol>2. Transfecção celular (dia 2)
NOTA: Aqui, as células são transfectadas com as construções de expressão pCMV5-NanoLuc-CRAF e pCMV5-14-3-3ζ-Halo, juntamente com o vetor vazio pCDNA3.1 (Figura 2).
<ol><li>Antes da transfecção, dilua os plasmídeos N-BRET para 5 ng/μL e pCDNA3.1 para 100 ng/μL e numere um conjunto de tubos estéreis de 1.7 mL.</li>
	<li>Adicione 100 μL de meios de transfecção (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) a cada tubo, juntamente com 5 ng de pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng de pCMV5-14-3-3ζ e 200 ng de PCDNA3.1.</li>
	<li>Adicione 2 μL de reagente de transfecção (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) e vortex suavemente para misturar. Gire os tubos brevemente em uma microcentrífuga para garantir que todo o líquido seja coletado no fundo dos tubos e, em seguida, incube a cerca de 25 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicione complexos de transfecção gota a gota às células e incube a 37 ° C / 10% CO2 por 16-20 h para permitir que as proteínas marcadas com Halo e Nano sejam expressas. NOTA: A adição de um DNA portador de vetor vazio (pCDNA3.1) é essencial para alcançar alta eficiência de transfecção das construções de expressão N-BRET. A falha em adicionar vetor vazio resulta em níveis de expressão reduzidos das proteínas 14-3-3ζ-Halo e Nano-CRAF e, por sua vez, resulta em proporções BRET fracas e inconsistentes, conforme discutido anteriormente22.</li>
</ol>3. Replaqueamento celular (Dia 3)
NOTA: Nesta etapa, as células são transferidas para uma placa de 384 poços e o ligante Halo 618 (+ligante; Tabela de Materiais) ou DMSO (+veículo) é adicionado para leitura das emissões BRET na etapa 4. As células restantes são transferidas para placas de cultura frescas de 6 poços para análise de western blot na Etapa 5 (Figura 2).
<ol><li>Recolha os seguintes materiais e prepare a área de trabalho conforme descrito abaixo.<ol><li>Usando um banho-maria a 37 °C, tripsina-EDTA pré-quente, juntamente com meios de ensaio sem soro e meios de ensaio suplementados com FBS a 10% (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes).</li>
		<li>Com base no número de amostras a serem medidas, pré-rotule três conjuntos de tubos estéreis de 1,7 mL (Conjunto 1-3) e um conjunto de tubos de fundo cônico estéreis de 15 mL. Equipar uma centrífuga de balde oscilante com insertos de tubo de 15 ml e pré-arrefecer a 4 °C.</li>
		<li>Coloque os seguintes itens na capa de cultura de tecidos: reservatórios de reagentes, placas de cultura de tecidos de 384 poços, placas de cultura de tecidos de 6 poços, uma pipeta multicanal e pontas, lâminas/câmaras de contagem de células e coloração azul de tripano (Tabela de Materiais), juntamente com os conjuntos de tubos de 1,7 mL 1-3.</li>
	</ol></li>
	<li>Colha e conte as células conforme descrito abaixo.<ol><li>Aspire o meio das placas de 6 poços e adicione 250 μL de tripsina-EDTA às células. Incube as placas de 6 poços a 37 °C até que as células comecem a se desprender (3-5 min).</li>
		<li>Adicione 1 mL de meio de ensaio suplementado com FBS a 10% em cada poço para neutralizar a tripsina e pipetar vigorosamente para cima e para baixo para gerar uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Transfira 1 mL da suspensão celular para os tubos de 15 mL pré-marcados. Adicione mais 1 mL de meio de ensaio suplementado com FBS a 10% a cada um dos tubos de 15 mL.</li>
		<li>Inverta os tubos 5x para misturar e transfira imediatamente 20 μL de suspensão celular para o conjunto de tubos 1.</li>
		<li>Centrifugue na centrífuga de balde oscilante pré-resfriada por 5 min a ~250 x g. Durante a etapa de centrifugação, misture 20 μL de coloração de células azuis de tripano com as células no conjunto de tubos 1 e, em seguida, conte as células usando um contador de células automatizado ou hemocitômetro. Um rendimento de 6-8 x 105 células/mL é típico.</li>
		<li>Remova os tubos de 15 mL da centrífuga e aspire o meio dos pellets celulares. Ressuspenda os grânulos celulares a 2 x 105 células/mL em meio de ensaio sem soro e pipete vigorosamente para gerar uma suspensão de célula única. NOTA: O uso de meios de ensaio sem soro é usado para quiescer as vias normais de sinalização celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Replaquetar células em placas de 384 poços e 6 poços, conforme descrito abaixo.<ol><li>Inverta os tubos de 15 mL várias vezes para garantir uma suspensão celular homogênea e transfira 500 μL para tubos de 1,7 mL conjunto 2 e conjunto 3.</li>
		<li>Adicione 0,5 μL de DMSO (+veículo) ao conjunto 2 e 0,5 μL de ligante Halo 618 (+ligante) ao conjunto de tubos 3 e pipeta para misturar.</li>
		<li>Transfira as suspensões de células +veículo e +ligante para poços separados de reservatórios de reagentes. Usando a pipeta multicanal (Tabela de Materiais), transfira 40 μL da suspensão da célula + veículo dos reservatórios de reagentes para os poços quadruplicados da placa de cultura de 384 poços. Repita esta etapa para as suspensões de células + ligantes.</li>
		<li>Transfira as células restantes para placas de cultura frescas de 6 poços. Incubar as placas de 384 e 6 poços durante a noite a 37 °C e 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Leitura das emissões BRET (Dia 4)
NOTA: Nesta etapa, o substrato de nanoluciferase (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes) é adicionado às células na placa de cultura de 384 poços e as emissões do aceptor N-BRET (618 nm) e do doador (460 nm) são lidas (Figura 2). Os índices BRET corrigidos são então calculados.
<ol><li>Pré-aqueça os meios de ensaio sem soro em banho-maria a 37 °C e descongele o substrato da nanoluciferase a 25 °C. Diluir o substrato da nanoluciferase 1:100 em meios de ensaio isentos de soro e transferir para um reservatório de reagente. Prepare o suficiente dessa mistura para adicionar 10 μL a cada poço da placa de 384 poços, mais 10% a 15% de volume extra.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal (Tabela de Materiais), transfira 10 μL da mistura de substrato para cada um dos poços que contêm células na placa de cultura de 384 poços. Gire suavemente a placa por 1 min, manualmente ou usando um agitador orbital.</li>
	<li>Insira a placa de 384 poços no leitor de placas multimodo e registre as emissões de 460 nm e 618 nm para todos os poços que contêm células. NOTA: Para o leitor de placas multimodo usado para esta etapa (consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes), foi usada uma altura de leitura de 6.5 mm, com uma medição de tempo de leitura de 0.1 s, no entanto, uma otimização adicional pode ser necessária se estiver usando outros leitores de placas.</li>
	<li>Calcule os rácios BRET brutos para +veículo e +ligante em unidades miliBRET (mBU) individualmente, utilizando a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Calcule o rácio BRET corrigido subtraindo o rácio BRET +veículo do rácio +Ligante (Quadro Suplementar 1). NOTA: Ao comparar os resultados de vários experimentos, as razões BRET corrigidas podem ser agrupadas e normalizadas para a média do par N-BRET Wildtype (WT), consistindo em Nano-CRAFWT e 14-3-3ζWT-Halo (Tabela Suplementar 1).</li>
</ol>5. Confirmação dos níveis de expressão proteica (dias 4 e 5)
NOTA: Nesta etapa, as células nas placas de 6 poços são lisadas e os níveis de expressão proteica das proteínas Nano-CRAF e 14-3-3ζ-Halo são determinados pela análise de western blot usando anticorpos específicos para as tags Halo e Nano. (Figura 2).
<ol><li>Adicione inibidores de protease e fosfatase ao tampão de lise NP40 (Tabela de Materiais), permitindo 200 μL de tampão de lise por amostra.</li>
	<li>Aspire meios de placas de 6 poços que contenham células. Lave as células uma vez com 1 mL de PBS frio e aspire.</li>
	<li>Adicione 125 μL de tampão de lise NP40 a cada poço e incube placas de 6 poços a 4 °C em uma plataforma oscilante por 15 min para lisar as células.</li>
	<li>Transfira lisados para tubos de 1,7 mL em gelo e centrifugue a 20.000 x g por 10 min a 4 ° C. Coloque os lisados limpos de volta no gelo e determine a concentração de proteína usando ensaios disponíveis comercialmente, como ensaios de Bradford ou ácido bicinchonínico (BCA).</li>
	<li>Normalize a concentração de proteína em todas as amostras, transferindo um volume apropriado de lisado e tampão de lise NP40 para tubos frescos de 1,7 mL para um volume total de 100 μL.</li>
	<li>Ferva 5x tampão de amostra de proteína (Tabela de Materiais) por 1 min e adicione 25 μL a cada amostra. Ferva as amostras por 5-6 min e, em seguida, pulse a centrífuga dos tubos brevemente para garantir que toda a amostra seja coletada na base do tubo.</li>
	<li>Carregue 25 μL de amostra em cada poço de géis de proteína duplicados (Gel 1 e Gel 2) e, em seguida, transfira proteínas para membranas de nitrocelulose ou PVDF usando procedimentos padrão de western blotting, conforme descrito anteriormente22.</li>
	<li>Bloqueie as membranas em BSA-PBS a 3% a 25 ° C por 30 min e, em seguida, incube as membranas durante a noite com anticorpo Halo (diluição 1:1.000; Gel 1) e nanoluciferase ou anticorpo CRAF (diluição 1:500; Gel 2) em solução salina tamponada com tris, suplementada com Tween-20 a 0,2% (TBST; Tabela de Materiais).</li>
	<li>Lave as membranas 1x por 5 min em 10 mL de TBST e, em seguida, incube em temperatura ambiente por 1 h com anticorpo secundário anti-HRP de camundongo, diluído 1:10.000 em TBST.</li>
	<li>Lave as membranas 3x em uma plataforma de balanço em 10 mL de TBST a 25 ° C por 5 min cada. Remova o TBST e visualize as bandas de proteínas usando reagentes ECL e um processador de filme de raios-X ou outro sistema de imagem apropriado.</li>
</ol>

CRAF-14-3-3 Análise de Interação em Células Vivas Usando uma Abordagem Baseada em BRET

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

Nada a divulgar.

Estudos anteriores mostraram que as proteínas 14-3-3 desempenham papéis críticos na ativação e inibição das quinases RAF. Compreender como esses eventos de ligação são regulados e os efeitos da modulação dessas interações na sinalização RAF e na oncogênese orientada por RAF pode revelar novas vulnerabilidades terapêuticas que visam a função CRAF. No entanto, o ciclo de ativação de Raf é suportado por uma infinidade de proteínas associadas, modificações pós-traducionais e mudanças na localizaç...

As quinases RAF (ARAF, BRAF e CRAF) são os efetores diretos das GTPases RAS e os membros iniciadores da cascata de quinase RAF-MEK-ERK pró-proliferativa/pró-sobrevivência. Estudos recentes mostraram que a expressão de CRAF desempenha um papel fundamental na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas e adenocarcinoma ductal pancreático 1,2,3,4,5. Além disso, as mutações germinativas do CRAF causam uma forma particularmente grave da RASopatia, a síndrome de Noonan 6,7. Compreender a regulação do CRAF é fundamental para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas bem-sucedidas que visam sua função nas células.
Todas as quinases RAF podem ser divididas em dois domínios funcionais, um domínio catalítico C-terminal (CAT) e um domínio regulador N-terminal (REG), que controla sua atividade (Figura 1A)8. O domínio REG engloba o domínio de ligação RAS (RBD), o domínio rico em cisteína (CRD) e uma região rica em serina/treonina (rica em S/T). Notavelmente, a região rica em S / T contém o sítio N ', que se liga a 14-3-3 de maneira dependente da fosforilação (S259 em CRAF; Figura 1A) 8. O domínio CAT engloba o domínio quinase, juntamente com um segundo local de ancoragem 14-3-3 de alta afinidade, conhecido como sítio C' (S621 em CRAF; Figura 1A) 8. A ligação diferencial de proteínas diméricas 14-3-3 aos sítios N 'e C', juntamente com o CRD, desempenha papéis críticos na ativação e inibição do RAF 9,10,11,12,13. Em condições normais de sinalização, a ativação do RAF é iniciada pelo seu recrutamento para a membrana plasmática pelo RAS, permitindo a formação de dímeros ativos, dos quais o heterodímero BRAF-CRAF é a forma ativa predominante14,15. Ensaios bioquímicos com BRAF e CRAF, juntamente com estruturas de microscopia eletrônica criogênica (Cryo-EM) de BRAF dimérico, indicam que um dímero 14-3-3 estabiliza dímeros RAF ativos ligando-se simultaneamente ao sítio C 'de ambos os protômeros RAF ( Figura 1B ) 9 , 13 , 16 , 17 . Por outro lado, estudos mostraram que, em condições quiescentes, o RAF adota uma confirmação citosólica e autoinibida, onde o domínio REG se liga ao domínio CAT e inibe sua atividade 12,18,19,20. Este estado fechado é estabilizado por um dímero 14-3-3 ligado ao CRD e ao sítio N' no domínio REG e ao sítio C' no domínio CAT (Figura 1B)10,13,21. No BRAF, este modelo é apoiado por estruturas Cryo-EM recentes de monômeros BRAF autoinibidos e por nossos estudos bioquímicos anteriores 10,12,13,21,22. No entanto, enquanto 14-3-3 é mostrado para desempenhar um papel inibitório na regulação CRAF23, um estado autoinibido semelhante a BRAF pode desempenhar um papel menor na regulação CRAF12; portanto, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos pelos quais as proteínas 14-3-3 regulam a atividade do CRAF. A regulação mediada por 14-3-3 das quinases RAF requer uma infinidade de eventos de fosforilação e desfosforilação de RAF, a ligação a várias proteínas reguladoras e interações com a membrana plasmática8. Portanto, é fundamental que as interações 14-3-3-RAF sejam medidas em condições fisiologicamente relevantes e na presença de uma bicamada lipídica intacta.
Para resolver esse problema, a tecnologia NanoBRET (doravante referida como N-BRET; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes do kit) foi utilizada para desenvolver um ensaio baseado em proximidade para medir as interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas (Figura 1C). Este sistema baseado em BRET mede as interações de duas proteínas de interesse (POI), onde uma proteína é marcada com um doador de nanoluciferase (Nano) e a outra com uma etiqueta Halo, para marcação com o ligante aceitador de energia Halo618 22,24. A interação das proteínas de interesse resulta na transferência de energia do doador para o aceitador, que por sua vez gera o sinal BRET (Figura 1C). A proteína doadora Nano extremamente brilhante (emissão (em) 460 nm) e o ligante Halo618 (em 618 nm) fornecem maior separação espectral e sensibilidade em relação ao BRET convencional, tornando-o uma plataforma ideal para estudar interações mais fracas e detectar mudanças sutis na ligação24. De fato, desenvolvemos anteriormente um ensaio baseado em N-BRET para medir as interações autoinibitórias dos domínios RAF REG e CAT, que foi essencial para a caracterização de um painel de mutações RASopatia no BRAF CRD e demonstrou a importância crítica desse domínio para manter a autoinibição e prevenir a ativação constitutiva de BRAF12.
O ensaio descrito aqui mede as interações de CRAF, fundido a uma etiqueta Nano N-terminal (Nano-CRAF), e a isoforma zeta de 14-3-3 fundida à etiqueta Halo C-terminal (14-3-3ζ-Halo; Figura 1C). Mostramos que as interações do Nano-CRAF com o 14-3-3ζ-Halo geram um sinal BRET robusto, que por sua vez pode ser interrompido por mutações que impedem a ligação do 14-3-3 ao sítio N '(S259A) e / ou ao sítio C '(S621A). O protocolo a seguir fornece etapas detalhadas para executar, otimizar e solucionar problemas deste ensaio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

O CRAF é um efetor primário das GTPases RAS e desempenha um papel crítico na tumorigênese de vários cânceres causados por KRAS. Além disso, o CRAF é um hotspot para mutações germinativas, que causam a RASopatia do desenvolvimento, síndrome de Noonan. Todas as quinases RAF contêm vários locais de ligação dependentes de fosforilação para proteínas reguladoras 14-3-3. A ligação diferencial de 14-3-3 a esses locais desempenha papéis essenciais na formação de dímeros RAF ativos na membrana plasmática sob condições de sinalização e na manutenção da autoinibição do RAF em condições quiescentes. Compreender como essas interações são reguladas e como elas podem ser moduladas é fundamental para identificar novas abordagens terapêuticas que visam a função da RAF. Aqui, descrevo um ensaio baseado em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) para medir as interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. Especificamente, este ensaio mede as interações de CRAF fundido a um doador de Nano luciferase e 14-3-3 fundido a um aceitador de tag Halo, onde a interação de RAF e 14-3-3 resulta na transferência de energia doador para aceitador e na geração do sinal BRET. O protocolo mostra ainda que esse sinal pode ser interrompido por mutações que impedem a ligação do 14-3-3 a cada um de seus locais de ancoragem de alta afinidade da RAF. Este protocolo descreve os procedimentos para semear, transfectar e replaquear as células, juntamente com instruções detalhadas para ler as emissões de CHUT, realizar análises de dados e confirmar os níveis de expressão de proteínas. Além disso, são fornecidos exemplos de resultados de ensaios, juntamente com etapas de otimização e solução de problemas.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

Autor em destaque: Integrando ensaios baseados em GREET e análise de mutação rara para decifrar a regulação da RAF quinase em células vivas

Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

Quando realizada conforme descrito neste protocolo (Figura 2), a interação de Nano-CRAFWT e 14-3-3ζ-Halo deve produzir razões BRET corrigidas de 50-60 mBU (Figura 3A; Tabela Suplementar 1). O CRAF contém dois locais de ancoragem 14-3-3 dependentes de fosforilação, o local N 'e o local C' (Figura 1) 8. Portanto, os controles apropriados para reduzir a ligação de CRAF: 14-3-...

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Este protocolo descreve um ensaio baseado em BRAKET para medir as interações da quinase CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas. O protocolo descreve as etapas para preparar as células, ler as emissões de BRET e analisar dados. Um exemplo de resultado com identificação de controles apropriados e solução de problemas para otimização de ensaio também é apresentado.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

O foco principal de nossa pesquisa é descobrir novas vulnerabilidades na via Ras-MAPK quinase por meio do estudo de mutações associadas a doenças raras. Recentemente, desenvolvemos outro ensaio baseado em PURE para medir as atividades auto-inibitórias das quinases RAF em células vivas. É importante ressaltar que este ensaio foi essencial para caracterizar um grupo de mutações germinativas raras no domínio rico em cisteína BRAF, o que demonstrou a importância crítica deste domínio para manter a autoinibição do BRAF e para prevenir a atividade biológica constitutiva do BRAF.Este ensaio mede as interações de 1433 proteínas com a RAF quinase CRAF, e essas interações desempenham papéis essenciais na mediação da função RAF tanto no desenvolvimento quanto na doença. Além disso, este ensaio combinado com ensaios previamente estabelecidos para medir a auto-inibição do RAF e a interação RAF-RAF formam a base de um kit de ferramentas para dissecar os mecanismos regulatórios das quinases RAF em células vivas.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

640 visualizações.  Medical University of South Carolina. O foco principal de nossa pesquisa é descobrir novas vulnerabilidades na via Ras-MAPK quinase por meio do estudo de mutações associadas a doenças raras. Recentemente, desenvolvemos outro ensaio baseado em PURE para medir as atividades auto-inibitórias das quinases RAF em células vivas. É importante ressaltar que este ensaio foi essencial para caracterizar um grupo de mutações germinativas raras no domínio rico em cisteína BRAF, o que demonstrou a importância crítica deste domíni...

Vídeo: Autor em destaque: Integrando ensaios baseados em GREET e análise de mutação rara para decifrar a regulação da RAF quinase em células vivas

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

Bioquímica

Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

Transfecção de células 293FT com construções de expressão de pCMV5-NanoLuc-CRAF e pCMV5-14-3-3ζ-halo

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.