Ensaio baseado em transferência de energia por ressonância de bioluminescência (BRET) para medir interações de CRAF com proteínas 14-3-3 em células vivas

O foco principal de nossa pesquisa é descobrir novas vulnerabilidades na via Ras-MAPK quinase por meio do estudo de mutações associadas a doenças raras. Recentemente, desenvolvemos outro ensaio baseado em PURE para medir as atividades auto-inibitórias das quinases RAF em células vivas. É importante ressaltar que este ensaio foi essencial para caracterizar um grupo de mutações germinativas raras no domínio rico em cisteína BRAF, o que demonstrou a importância crítica deste domínio para manter a autoinibição do BRAF e para prevenir a atividade biológica constitutiva do BRAF.

Este ensaio mede as interações de 1433 proteínas com a RAF quinase CRAF, e essas interações desempenham papéis essenciais na mediação da função RAF tanto no desenvolvimento quanto na doença. Além disso, este ensaio combinado com ensaios previamente estabelecidos para medir a auto-inibição do RAF e a interação RAF-RAF formam a base de um kit de ferramentas para dissecar os mecanismos regulatórios das quinases RAF em células vivas.