Para começar, rotule três conjuntos de tubos estéreis de 1,7 mililitro e um conjunto de tubos de fundo cônico estéreis de 15 mililitros. Prepare uma centrífuga de balde oscilante com inserções de tubo de 15 mililitros e pré-resfrie a quatro graus Celsius. Pegue a placa de cultura de células de seis poços com células transfectadas de 293FT.
Aspire a mídia dos poços. Adicione 250 microlitros de tripsina-EDTA e incube a 37 graus até que as células comecem a se desprender. Em seguida, adicione um mililitro de meio de ensaio suplementado com 10% FBS a cada poço e pipete vigorosamente para criar uma suspensão de célula única.
Transfira um mililitro de suspensão celular para tubos pré-rotulados de 15 mililitros. Adicione um mililitro de meio de ensaio suplementado com 10% FBS a cada um desses tubos e inverta cinco vezes para misturar. Em seguida, transfira imediatamente 20 microlitros de suspensão celular para o conjunto de tubos um.
Agora centrifugue os tubos de 15 mililitros por cinco minutos a 250 g em uma centrífuga pré-resfriada. Misture 20 microlitros de coloração de células azuis de tripano com as células do conjunto um e conte usando um contador de células ou hemocitômetro. Depois de remover os tubos de 15 mililitros da centrífuga, aspire o meio das pastilhas celulares e ressuspenda os pastilhas em meios de ensaio sem soro para criar uma suspensão de célula única.
Para reinflar células em placas de 384 poços e seis poços, inverta os tubos de 15 mililitros várias vezes para obter uma suspensão de células homogênea e transfira 500 microlitros para tubos de 1,7 mililitro no conjunto dois e três. Adicione 0,5 microlitros de DMSO para definir dois e 0,5 microlitros de ligante Halo 618 ao conjunto de tubos três e misture bem. Transfira o DMSO e as suspensões de células positivas para ligantes separados para poços separados de reservatórios de reagentes.
Use uma pipeta multicanal para transferir 40 microlitros de cada suspensão para a placa de cultura de 384 poços. Transfira as células restantes para placas de cultura frescas de seis poços para análise subsequente de western blot e incube as placas de 384 e seis poços durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Tome meios de ensaio sem soro pré-aquecidos a 37 graus Celsius.
Diluir o substrato de nanoluciferase descongelado 1:100 em meio de ensaio isento de soro e transferi-lo para um reservatório de reagente. Usando uma pipeta multicanal, transfira 10 microlitros de mistura de substrato para cada poço da placa de cultura de 384 poços. Gire suavemente a placa por um minuto.
Insira a placa de 384 poços em um leitor de placas multimodo e registre as emissões de 460 e 618 nanômetros de todos os poços com células. Calcule as razões BRET brutas para veículos positivos e ligantes positivos em unidades miliBRET usando a equação fornecida. Calcule a razão BRET corrigida subtraindo a razão BRET positiva do veículo daquela do positivo do ligante positivo.
O mutante nano-CRAFS259A reduz o sinal BRET em aproximadamente 45% e o mutante nano-CRAFS621A em cerca de 25% O mutante duplo quase elimina o sinal BRET.
