Para começar, prepare os suportes de braçadeira e as abraçadeiras de metal. Coloque suportes de fixação correspondentes com uma braçadeira de metal cada na estação de montagem. Coloque pedaços de papel autoclavado molhados em cima das abraçadeiras de metal.
Corte o papel ao longo das bordas internas das braçadeiras com o bisturi. Corte mais dois pedaços de papel menores e mantenha-os molhados. Usando pinças pontiagudas, coloque oito explantes de núcleo no papel entre as abraçadeiras de metal com seus pontos finais nas pinças.
Cubra os pontos finais dos explantes do núcleo com pedaços de papel menores e coloque grampos de metal por cima. Use uma chave de fenda e pequenos parafusos para fixar os explantes do núcleo entre as abraçadeiras metálicas e o suporte da braçadeira. Transfira cuidadosamente os explantes de núcleo pinçados para câmaras de cultura de silicone e preencha essas câmaras com dois mililitros de meio de cultura celular padrão.
Em seguida, fixe o conjunto com parafusos adicionais. Para preparar o hidrogel de colágeno, primeiro remova as células-alvo de placas de cultura de tecidos usando uma solução de descolamento celular. Em seguida, centrifugar a 400G por cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, ressuspender em um mililitro de meio de cultura padrão.
Em seguida, prepare uma solução de reticulação misturando 10 microlitros de PBS, 1,28 microlitros de NaOH de um molar e 8,72 microlitros de água bidestilada por assemblóide. Adicione a suspensão celular de até 12 assemblóides e coloque o tubo sobre gelo. Ajustar a suspensão celular de modo a atingir as seguintes concentrações finais.
Separadamente, prepare uma solução de colágeno adicionando 80 microlitros de colágeno um por assemblóide e coloque o tubo sobre gelo. Uma vez que as soluções estejam prontas no gelo, aspirar o meio de cultura celular das câmaras contendo os explantes de núcleo pinçados. Adicione uma solução de colágeno à solução de reticulação e misture pipetando rapidamente sem criar bolhas.
Adicione 200 microlitros da solução mista nos sulcos das câmaras de silicone para cobrir os explantes individuais do núcleo do tendão. Deixe os hidrogéis polimerizarem por 50 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, preencha cuidadosamente as câmaras de cultura de silicone com 1,5 mililitros do respectivo meio de co-cultura, pipetando-o nos cantos das câmaras.
Coloque as câmaras em uma grande placa de Petri ou em uma caixa estéril antes de colocá-las em uma incubadora. Cultivar os assemblóides em condições adequadas, trocando o meio de cultura duas vezes por semana. Retire os assemblóides das braçadeiras com tesoura.
Se necessário, use uma pinça para separar os explantes do núcleo do compartimento externo de hidrogel. Ao cultivar o assemblóide em condições de cultura semelhante a lesão por mais de 21 dias, observou-se que o explante do núcleo permaneceu mecanicamente esticável, inalterado na aparência, visualmente distinguível e fisicamente separável do hidrogel circundante. Além disso, o hidrogel circundante compactou-se ao longo do tempo, dependendo da população de células semeadas com fibroblastos derivados do tendão de Aquiles contraindo seu hidrogel circundante mais rapidamente.
A avaliação por microscopia confocal da viabilidade, morfologia e dispersão celular no hidrogel de colágeno 3D revelou que a viabilidade foi mantida durante o cultivo do assemblóide até pelo menos o sétimo dia. Além disso, a expressão gênica de Vegfa e Mmps aumentou fortemente em explantes centrais, como visto pela análise transcriptômica. Da mesma forma, a análise do secretoma detectou a presença de citocinas, como o fator de crescimento endotelial vascular, nos explantes centrais.
