Para começar, pegue um slide e adicione duas tiras finas de fita adesiva dupla face para se preparar para a imagem. Pipete aproximadamente 10 a 15 microlitros de meio de montagem entre as duas tiras de fita para montagem cerebral. transfira o rótulo drosophila brains para uma lâmina de microscópio com uma ponta de pipeta P20 pré-enxaguada com PBS e 0,2% Triton X-100.
Depois que os cérebros forem transferidos, use um pincel fino para alinhá-los, garantindo que os lobos antenais fiquem voltados para cima. Depois de orientar os cérebros, cubra-os com uma lamínula de vidro. Em seguida, preencha as laterais da lamínula com meio de montagem adicional.
Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente. Depois de secar bem a lâmina, guarde-a na geladeira para imagens subsequentes. Use um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma objetiva de imersão em óleo 63X para geração de imagens.
Empregue um laser de argônio 488 e neônio de hélio 543 para obter imagens dos glomérulos sinápticos de um lobo antenal e dos neurônios sensoriais olfativos Or42a. Determine o ganho óptico e o deslocamento para ambos os canais. Posicione a imagem no centro do cérebro e concentre-se nos glomérulos VM7.
Localize aproximadamente o buraco no meio do cérebro. Selecione a resolução de imagem de 1024 por 1024. Capture uma projeção de pilha Z confocal inteira através do lobo antenal para garantir que a inervação completa do neurônio Or42a dos glomérulos VM7 seja capturada.
Carregue a imagem cega do genótipo ou condição em Fiji. Para dividir os canais da linha de laser, vá para a imagem, clique em cor e selecione dividir canais. No canal sensorial olfativo Or42a, percorra a pilha Z para determinar quais fatias contêm a inervação do neurônio Or42a, identificando o início e o fim da fluorescência.
Para criar uma projeção de fatias de soma que inclua apenas fatias com inervação de neurônios Or42a, clique na imagem e vá para pilhas. Em seguida, clique em Projeto Z, selecione a soma de fatias e insira o intervalo desejado. Use a ferramenta laço em Fiji para traçar o contorno da inervação do neurônio Or42a no glomérulo VM7.
Multiplique a circunferência da área traçada pelo número de fatias da pilha Z e a espessura de cada fatia para calcular o volume de inervação do glomérulo sináptico VM7. Após 24 horas de exposição a um veículo odorante de controle, a inervação densa de Or42a MCD: GFP persiste nos glomérulos VM7 de ambos os lobos antenais. Em contraste, uma exposição de 24 horas ao odor 25%EB causa poda significativa e perda de volume glomerular sináptico.
O aumento da concentração de odorante EB causa uma poda progressivamente maior dos glomérulos sinápticos. Quantificações representativas para esta faixa de concentrações de odorante EB mostraram resultados semelhantes para intensidade de fluorescência e volume de inervação.
