Para começar, faça uma cultura confluente de 70 a 90% de fibroblastos uterinos humanos. Aspirar o meio dos frascos. Lave as células com cinco mililitros de DPBS quente sem cálcio e magnésio.
Depois de aspirar o DPBS, pipetar quatro mililitros de tripsina EDTA quente em cada frasco. Incube as células a 37 graus Celsius por três a cinco minutos até que as células se desprendam. Em seguida, adicione seis mililitros de gotejamento e solução neutralizante em cada frasco.
Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Use uma pipeta para misturar bem a suspensão e pegue uma alíquota de 10 microlitros para contagem de células. Misture 10 microlitros da suspensão celular com 10 microlitros de Trypan Blue.
Transfira a suspensão de células coradas para um hemocitômetro para contagem de células. Em seguida, centrifugar a suspensão da célula a 300 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em meio de fibroblastos quente.
Agora lave o canal basal de um chip de órgão microfluídico com 200 microlitros de meio fibroblasto. Em seguida, lave o canal apical com 200 microlitros de meio epitelial vaginal aquecido. Adicione 200 microlitros de meio epitelial vaginal completo à entrada do canal apical, enquanto obstrui a saída com uma ponta de pipeta.
Dispense o meio até que os volumes da ponta de entrada e saída sejam iguais. Em seguida, solte a ponta da pipeta, deixando a ponta na entrada. Pipete lentamente 50 microlitros da suspensão de células de fibroblastos uterinos humanos na entrada do canal basal, enquanto aspira simultaneamente da saída.
Remova a ponta da pipeta da entrada quando aproximadamente dois microlitros da suspensão celular permanecerem na ponta da pipeta. Vire os chips de plugue de cabeça para baixo em um rack de tubo de 15 mililitros. Verifique os chips após a incubação quanto à fixação das células.
Em seguida, tampe a saída do canal basal com uma ponta de pipeta. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de fibroblastos à entrada do canal basal sem empurrar o êmbolo da pipeta para baixo. Solte a ponta da pipeta para permitir que o meio flua livremente através do canal até a ponta da pipeta de saída por fluxo gravitacional.
Incube os chips semeados com fibroblastos durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de suplementação de dióxido de carbono.
