Para começar, tome células RSC96 eletricamente estimuladas em placas de cultura. Em seguida, use uma caneta de histologia para desenhar círculos em locais onde as células são distribuídas uniformemente na lamínula. Adicione 50 a 100 microlitros de solução de trabalho de permeabilização às células e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.
Em seguida, lave as células três vezes com PBS por cinco minutos cada. Em seguida, adicione 3% BSA dentro dos círculos para cobrir o tecido uniformemente e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova suavemente a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário adequadamente diluído às células.
Coloque a placa de cultura de células em uma caixa úmida e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células três vezes com PBS por cinco minutos cada, agitando continuamente. Adicione o anticorpo secundário correspondente e incube em temperatura ambiente por 50 minutos.
No final da incubação, coloque a lamínula no PBS e lave-a três vezes, agitando por cinco minutos cada. Em seguida, deixe a lâmina secar e adicione a solução de coloração DAPI à lâmina seca. Por fim, sele a lamínula seca com um meio de montagem anti-desbotamento para fluorescência.
Adquira imagens usando comprimentos de onda específicos de excitação e emissão para Alexa Fluor 488, SCI3 e SCI5. A análise microscópica mostrou células citoplasmáticas S-100 beta positivas espalhadas em vermelho em todos os grupos, e o aumento da densidade óptica integrada da fluorescência beta S-100 foi observado no grupo de cinco quilovolts por centímetro em comparação com os grupos controle e 10 quilovolts por centímetro. Células GFAP e Sox10-positivas com citoplasma disperso foram observadas em todos os grupos durante os ensaios de rastreamento celular.
No entanto, a expressão de GFAP foi significativamente menor no grupo de cinco quilovolts por centímetro em comparação com os grupos controle e 10 quilovolts por centímetro. As células RSC96 no grupo de cinco quilovolts por centímetro mostraram um valor médio de cinza significativamente maior da expressão de Sox10, sugerindo expressão aprimorada de Sox10.
