Este trabalho foi financiado pelo Projeto Nacional de Desenvolvimento de Instrumentos e Equipamentos Científicos Chave (NO.82027803).

1. Descongelamento de células RSC96 criopreservadas
<ol><li>Descongele o criogênico contendo 1 mL de suspensão celular agitando-o rapidamente em banho-maria a 37 ° C e, em seguida, adicione-o a um tubo de centrífuga contendo 4-6 mL de meio de cultura completo e misture bem.</li>
	<li>Centrifugue a 1000 x g durante 3-5 min, elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 3 ml de meio de cultura completo.</li>
	<li>Adicionar a suspensão celular a um balão de cultura (ou cápsula) contendo 6-8 ml de meio de cultura completo e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, observe o crescimento e a densidade celular ao microscópio.</li>
</ol>2. Passagem celular:
NOTA: Se a densidade celular atingir 80% -90%, ela está pronta para a passagem.
<ol><li>Descarte o meio de cultura e enxágue as células 1-2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons de cálcio e magnésio.</li>
	<li>Adicionar 0,25% (p/v) de tripsina-0,53 mM de EDTA ao balão de cultura (1-2 ml para um balão T25, 2-3 ml para um balão T75) e incubar a 37 °C durante 1-2 min.</li>
	<li>Observe o descolamento da célula ao microscópio. Se a maioria das células se tornar redonda e se desprender, retorne rapidamente o frasco para a área de trabalho, bata suavemente no frasco e adicione 3-4 mL de meio de cultura contendo 10% de FBS para interromper a digestão.</li>
	<li>Misture o conteúdo, aspire a solução e centrifugue a 1000 x g por 5 min. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células adicionando 1-2 mL de meio de cultura fresco e pipetando suavemente.</li>
	<li>Transferir a suspensão celular para um novo balão T25 na proporção de 1:2 e adicionar 7 ml de meio de cultura.</li>
</ol>3. Operação do dispositivo nsPEF
<ol><li>Ressuspenda as células RSC96 em 1 mL de meio de cultura DMEM e transfira-as para placas colorimétricas com eletrodos em ambos os lados.</li>
	<li>Ligue o interruptor de alimentação.</li>
	<li>Ajuste os parâmetros girando o botão no instrumento para alterar a intensidade do campo elétrico. As intensidades estabelecidas neste estudo são 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm e 40 kV/cm.</li>
	<li>Gire cuidadosamente os eletrodos até que apareçam faíscas, permitindo que as células recebam 5 pulsos de nsPEF de acordo com as intensidades de intensidade de campo predefinidas antes de separar imediatamente os dois eletrodos. Após este tratamento, pegue as células do grupo experimental tratadas com nsPEF e as células do grupo controle não tratadas para realizar as seções 4-6, respectivamente, após um certo período de cultura celular (1 dia neste experimento).</li>
</ol>4. Ensaio de contagem de células-8 (CCK-8)
<ol><li>Preparar uma suspensão celular de uma concentração específica a partir de células RSC96 estimuladas com estimulação elétrica. Adicione 100 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços. Considerando os requisitos do ensaio CCK-8, controlar o número total de células no kit de reagentes entre 1 x 103 e 1 x 106.</li>
	<li>Pegue 10 μL de solução de CCK-8 do kit e adicione-o à placa de cultura de células de 96 poços. Incubar numa incubadora de CO2 a 37 °C durante mais 30 minutos a 4 h.</li>
	<li>Meça a absorbância. Use medição de comprimento de onda duplo com um comprimento de onda de detecção de 430-490 nm e um comprimento de onda de referência de 600-650 nm.</li>
	<li>Determine a intensidade da intensidade do campo para experimentos subsequentes com base nos resultados experimentais da proliferação celular. Selecione células com boa proliferação para experimentos subsequentes.</li>
</ol>5. Ensaio de arranhões celulares
<ol><li>Em cada poço de uma placa de seis poços, semeie 3 x 105 células com um volume total de 2 mL por poço. Aproximadamente 72 h depois, as células cobrirão o poço. Realizar o ensaio no grupo experimental e no grupo de controlo separadamente.</li>
	<li>Use uma ponta de pipeta para desenhar uma linha horizontal na parte inferior do poço de cultura. Certifique-se de que a ponta da pipeta esteja mantida na vertical e tente evitar incliná-la.</li>
	<li>Aspire o meio de cultura e lave com PBS 2-3 vezes.</li>
	<li>Adicione 2 mL de meio sem soro a cada poço.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora a 37 °C. Tire fotos sob uma ampliação de quatro vezes do microscópio invertido em 0 h e 24 h para observar mudanças na migração celular.</li>
</ol>6. Imunofluorescência
<ol><li>Permeabilização celular:<ol><li>Depois de pipetar suavemente as suspensões celulares em placas de cultura, desenhe círculos com uma caneta histológica nos locais onde as células são distribuídas uniformemente na lamínula. Trate o grupo controle e os diferentes grupos experimentais separadamente.</li>
		<li>Adicione 50-100 μL de solução de trabalho de permeabilização (0,25-0,5% Triton X-100) e incube em temperatura ambiente (RT) por 20 min. Lave três vezes com PBS por 5 minutos de cada vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio de soro: Adicione 3% de BSA dentro dos círculos para cobrir o tecido uniformemente. Incubar em RT por 30 min.</li>
	<li>Incubação de anticorpos primários: Remova suavemente a solução de bloqueio e adicione o anticorpo primário adequadamente diluído (derivado de camundongo, diluído a 1:300) aos poços celulares. Colocar a placa de cultura de células numa caixa húmida e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Incubação secundária de anticorpos: Coloque a placa celular em um agitador e lave-a três vezes por 5 minutos de cada vez. Adicione o anticorpo secundário correspondente (IgG anti-camundongo de cabra marcado com CY3, diluído a 1:300) e incube em RT por 50 min.</li>
	<li>Coloração nuclear DAPI:<ol><li>Coloque a lamínula em PBS (pH 7,4) em uma coqueteleira e lave três vezes por 5 minutos de cada vez.</li>
		<li>Depois de secar suavemente a lâmina, adicione a solução de coloração DAPI (2 μg/mL, 0,5 mL por círculo) dentro dos círculos e incube em RT por 10 min em uma sala escura.</li>
	</ol></li>
	<li>Montagem: Coloque a lamínula em PBS (pH 7.4) em uma coqueteleira e lave três vezes por 5 minutos de cada vez. Depois de secar suavemente a lâmina, sele a lamínula com um meio de montagem anti-desbotamento para fluorescência.</li>
	<li>Aquisição de imagem: Excite DAPI em um comprimento de onda de 330-380 nm e detecte a emissão em 420 nm; excitar a 465-495 nm e detectar emissão a 515-555 nm para AF488; excitar a 510-560 nm e detectar emissão a 590 nm para CY3; excitar a 608-648 nm e detectar emissão a 672-712 nm para CY5.</li>
</ol>

Melhorando a regeneração do nervo periférico com células de Schwann estimuladas por nsPEF

<ol>
	<li>Jing, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+electrical+stimulation+with+different+electric-field+intensities+in+the+regulation+of+the+differentiation+of+PC12+cells.">Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells.</a> ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).</li><li>Aguilar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+functional+Schwann+cells+from+adipose-derived+stem+cells+in+defined+conditions.">Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions.</a> Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).</li><li>Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+via+repeated+biphasic+conducting+materials+for+peripheral+nerve+regeneration.">Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).</li><li>Daly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+characterization+of+multiple+biomaterial+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair.</a> Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).</li><li>Lee, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=End-to-side+neurorrhaphy+using+an+electrospun+PCL/collagen+nerve+conduit+for+complex+peripheral+motor+nerve+regeneration.">End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration.</a> Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).</li><li>Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peculiarities+of+neurostimulation+by+intense+nanosecond+pulsed+electric+fields:+how+to+avoid+firing+in+peripheral+nerve+fibers.">Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).</li><li>Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+spinal+cord+injury.">Cell transplantation therapy for spinal cord injury.</a> Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).</li><li>Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. 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B., Dun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+Schwann+cells+direct+axon+regeneration+within+the+peripheral+nerve+bridge.">Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge.</a> Glia. 69 (2), 235-254 (2021).</li><li>Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+peripheral+nerve+regeneration.">Transcriptional control of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).</li><li>Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. 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E., N&#250;&#241;ez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF):+Opening+the+biotechnological+Pandora's+box.">Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora's box.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+nanoelectroablation+therapy+for+basal+cell+carcinoma:+proof+of+method.">First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method.</a> Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).</li><li>Nuccitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-thermal+nanoelectroablation+of+UV-induced+murine+melanomas+stimulates+an+immune+response.">Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).</li><li>Carr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanosecond+pulsed+electric+field+(nsPEF)+can+affect+membrane+permeabilization+and+cellular+viability+in+a+3D+spheroids+tumor+model.">A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).</li><li>Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+analysis+of+infrared+irradiation-assisted+nanosecond-pulsed+tumor+ablation.">Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation.</a> Sci Rep. 10 (1), 5122 (2020).</li><li>Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+to+enhance+peripheral+nerve+regeneration:+Update+in+molecular+investigations+and+clinical+translation.">Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation.</a> Exp Neurol. 332, 113397 (2020).</li><li>Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -. L., Moore, A. 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M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+regeneration.">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li><li>Yin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+papilloma+and+squamous+cell+carcinoma+therapy+utilizing+nanosecond+pulsed+electric+fields+(nsPEF).">Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF).</a> PloS One. 7 (8), e43891 (2012).</li><li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoexcited+wireless+electrical+stimulation+elevates+nerve+cell+growth.">Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).</li><li>Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gold+nanorods+combined+with+low-intensity+nsPEFs+enhance+antimelanoma+efficacy+in+vitro.">Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro.</a> Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).</li><li>Ho, T. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels:+Properties+and+applications+in+biomedicine.">Hydrogels: Properties and applications in biomedicine.</a> Molecules. 27 (9), 2902 (2022).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nos últimos anos, a aplicação do nsPEF tem experimentado um crescimento impulsionado, conforme relatado. O nsPEF tem um efeito altamente direcionado apenas na área desejada, fornecendo energia suficiente para tratar sem causar danos térmicos adicionais, tornando-o mais seguro para o corpo humano28. Essas características lhe conferem perspectivas translacionais promissoras no tratamento de tumores e regeneração nervosa. No entanto, alguns estudos propuseram algumas limitações do nsPEF. Co...

A cada ano, milhões de pessoas são afetadas por lesões nervosas envolvendo tanto o sistema nervoso periférico (SNP) quanto o sistema nervoso central (SNC)1. Estudos demonstraram que a capacidade de reparo axonal do SNC é bastante limitada após lesões nervosas, enquanto o SNP mostra capacidade aumentada devido à plasticidade significativa das SCs2. No entanto, alcançar a regeneração completa após lesões de nervos periféricos permanece árduo e continua a representar um desafio significativo para a saúde humana 3,4. Atualmente, os autoenxertos continuam sendo um tratamento comum, apesar das desvantagens da morbidade do local doador e da disponibilidade limitada5. Essa situação levou os pesquisadores a explorar terapias alternativas, incluindo materiais6, fatores moleculares7 e estimulação elétrica (ES). Como fator promotor do crescimento axonal e da regeneração nervosa8, a escolha de um método apropriado de ES e a exploração da relação entre ES e SCs tornam-se essenciais.
As SCs são as principais células gliais do SNP, desempenhando um papel crucial na regeneração do SNP 9,10. Após lesões de nervos periféricos, os SCs passam por ativação rápida, reprogramação extensa2 e transição de um estado formador de mielina para uma morfologia de suporte ao crescimento para conduzir a regeneração do nervo2. Uma proliferação substancial de SCs ocorre na extremidade distal do nervo lesado, enquanto as SCs do coto distal sofrem proliferação e alongamento para formar a banda de Bungner, que são necessárias para guiar os axônios a crescerem em direção ao órgão-alvo11. Além disso, os SCs dos cotos nervosos proximal e distal migram para a ponte nervosa para formar cordões SC promovendo a regeneração do axônio12. Além disso, estudos anteriores demonstraram que a síntese e a secreção de fatores relevantes relacionados às SCs mudam nos casos de regeneração nervosa periférica, incluindo fatores transcricionais13, fatores neurotróficos14 e reguladores da mielinização13. Isso também fornece indicadores para avaliar a atividade das CTs. Com base nisso, a promoção da proliferação, migração, síntese e secreção de SC de fatores relevantes têm sido extensivamente investigadas para melhorar a regeneração nervosa periférica15.
Estudos anteriores demonstraram a possibilidade do uso do ES para regeneração nervosa1. Uma explicação amplamente aceita é que o ES pode induzir a despolarização das membranas celulares, alterar o potencial da membrana e afetar as funções das proteínas da membrana, alterando as distribuições de carga nessas biomoléculas1. No entanto, o PFE intenso amplamente aplicado pode causar dor intensa, contrações musculares involuntárias e fibrilação cardíaca8. Também aumenta a atividade da creatina quinase (CK), diminui a força muscular e induz o desenvolvimento de dor muscular de início tardio (DOMS)16. O nsPEF é uma técnica emergente que estimula cobaias com campos elétricos de alta voltagem dentro de uma duração de pulso de nanossegundos, e está gradualmente sendo usada em pesquisas em nível celular17,18. Estudos anteriores relataram que a possível justificativa do nsPEF promover a proliferação celular e a atividade das organelas é a formação de nanoporos de membrana e a ativação de canais iônicos, o que leva a um aumento na concentração citoplasmática de Ca2+ 19. O nsPEF utiliza a tecnologia de energia de pulso para carregar a membrana celular, produzindo pulsos caracterizados por curta duração, tempo de subida rápido, alta potência e baixa densidade de energia20. Essas características sugerem que o nsPEF pode ser um modo preferido com efeitos colaterais mínimos de estimulação8. Além disso, o nsPEF oferece vantagens como procedimentos minimamente invasivos, reversibilidade, ajuste e não destrutividade aos tecidos neurais em comparação com intervenções cirúrgicas. Uma das principais direções de pesquisa do nsPEF no campo biomédico é sua aplicação para ablação de tecido tumoral usando estimulação de campo elétrico de alta energia 21,22,23. Alguns resultados de pesquisas indicam que o 12-nsPEF pode estimular os nervos periféricos sem causar danos24. No entanto, atualmente, há evidências limitadas sobre a aplicação do nsPEF no campo da regeneração nervosa. Além disso, estimular SCs usando nsPEF é uma tentativa pioneira, contribuindo para mais pesquisas in vivo e clínicas. Este estudo explora se a estimulação nsPEF de SCs pode promover a regeneração nervosa e fornecer uma base confiável para pesquisas subsequentes aprofundadas e sistemáticas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB12144-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-S100 beta Mouse mAb</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB14146-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GC305010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-labeled goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>GB21302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Staining Reagent</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorizing shaker</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>DS-2S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage Power Supply for nsPEF</td>
			<td>Matsusada Precision Inc.</td>
			<td>AU-60P1.6-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histochemical pen</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane breaking liquid</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G6012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MS6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS powdered</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>G0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>NIKON ECLIPSE C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody</td>
			<td>Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>BS-20563R-AF488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSC96 Schwann cells</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>STCC30007G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanister</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td>Pannoramic MIDI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special cable for nsPEF</td>
			<td>Times Microwave Systems</td>
			<td>M17/78-RG217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbine mixer</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>MV-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

regulating schwann cell growth by nanosecond pulsed electric field for peripheral nerve regeneration in vitro

As células de Schwann (SCs) são células mielinizantes do sistema nervoso periférico, desempenhando um papel crucial na regeneração dos nervos periféricos. O Campo Elétrico de Pulso de Nanossegundos (nsPEF) é um método emergente aplicável na estimulação elétrica nervosa que demonstrou ser eficaz na estimulação da proliferação celular e outros processos biológicos. Com o objetivo de avaliar se os SCs sofrem mudanças significativas sob nsPEF e ajudar a explorar o potencial de novos métodos de regeneração de nervos periféricos, as células RSC96 cultivadas foram submetidas à estimulação nsPEF a 5 kV e 10 kV, seguida de cultivo contínuo por 3-4 dias. Posteriormente, alguns fatores relevantes expressos por SCs foram avaliados para demonstrar a estimulação bem-sucedida, incluindo a proteína marcadora específica, o fator neurotrófico, o fator de transcrição e o regulador da mielinização. Os resultados representativos mostraram que o nsPEF aumentou significativamente a proliferação e migração de SCs e a capacidade de sintetizar fatores relevantes que contribuem positivamente para a regeneração dos nervos periféricos. Simultaneamente, a menor expressão de GFAP indicou o prognóstico benigno de lesões de nervos periféricos. Todos esses resultados mostram que o nsPEF tem grande potencial como método de tratamento eficiente para lesões de nervos periféricos, estimulando as SCs.

Each year, millions of people are affected by nerve injuries involving both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS)1. Studies have demonstrated that the axonal repair capacity of the CNS is quite limited after nerve injuries, while the PNS shows enhanced capacity due to the significant plasticity of SCs2. Nevertheless, achieving complete regeneration after peripheral nerve injuries remains arduous and continues to pose a significant challenge to human health3,4. Nowadays, autografts have remained a common treatment despite the drawbacks of donor site morbidity and limited availability5. This situation has prompted researchers to explore alternative therapies, including materials6, molecular factors7, and electrical stimulation (ES). As a factor promoting axonal growth and nerve regeneration8, choosing an appropriate method of ES and exploring the relationship between ES and SCs become essential.
SCs are the main glial cells of the PNS, playing a crucial role in the regeneration of the PNS9,10. Following peripheral nerve injuries, SCs undergo rapid activation, extensive reprogramming2,&#160;and transition from a myelin-forming state to a growth-supportive morphology to conduct the regeneration of the nerve2. A substantial proliferation of SCs occurs at the distal end of the injured nerve, while SCs of the distal stump undergo proliferation and elongation to form Bungner&#39;s band, which are necessary to guide axons to grow towards the target organ11. Moreover, SCs from the proximal and distal nerve stumps migrate into the nerve bridge to form SC cords promoting axon regeneration12. Furthermore, previous studies have demonstrated that the synthesis and secretion of relevant factors related to SCs change in cases of peripheral nerve regeneration, including transcriptional factors13, neurotrophic factors14, and myelination regulators13. This also provides indicators for assessing the activity of SCs. Based on these, the promotion of SC proliferation, migration, synthesis, and secretion of relevant factors have been extensively investigated for improving peripheral nerve regeneration15.
Previous studies have demonstrated the possibility of using ES for nerve regeneration1. A widely accepted explanation is that ES can induce depolarization of cell membranes, alter membrane potential, and affect membrane protein functions by changing the charge distributions on these biomolecules1. However, widely applied Intense PEF may cause severe pain, involuntary muscle contractions, and heart fibrillation8. It also increases creatine kinase (CK) activity, decreases muscle strength, and induces the development of delayed onset muscle soreness (DOMS)16. nsPEF is an emerging technique that stimulates test subjects with high-voltage electric fields within a nanosecond pulse duration, and it is gradually being used in cellular-level research17,18. Previous studies have reported that the possible rationale of nsPEF promoting cell proliferation and organelle activity is the formation of membrane nanopores and the activation of ionic channels, which leads to an increase in cytoplasmic Ca2+ concentration19. nsPEF utilizes pulse power technology to charge the cell membrane, producing pulses characterized by short duration, rapid rise time, high power, and low energy density20. These characteristics suggest that nsPEF may be a preferred mode with minimal stimulation side effects8. Furthermore, nsPEF offers advantages such as minimally invasive procedures, reversibility, adjustability, and non-destructiveness to neural tissues compared to surgical interventions. One mainstream research direction of nsPEF in the biomedical field is its application for tumor tissue ablation using high-energy electric field stimulation21,22,23. Some research results indicate that 12-nsPEF can stimulate peripheral nerves without causing damage24. However, at present, there is limited evidence regarding the application of nsPEF in the field of nerve regeneration. Moreover, stimulating SCs using nsPEF is a pioneering attempt, contributing to further in vivo and clinical research. This study explores whether nsPEF stimulation of SCs can promote nerve regeneration and provide a reliable basis for subsequent in-depth and systematic research.

Autor em destaque: uso inovador de nsPEF para aumentar a regeneração de nervos periféricos

Regulando o crescimento de células de Schwann por campo elétrico pulsado de nanossegundos para regeneração de nervos periféricos in vitro

Our research focuses on promoting peripheral nerve regeneration by nsPEF stimulated swan cells. We hope to develop a new way to activate swan cells efficiently as nerve regeneration is quite difficult in most cases. We innovatively use a nanosecond post electric field nsPEF to activate swan cells.We are delighted to find that nsPEF may be a preferred mode for peripheral nerve regeneration with minimal stimulation side effects. Besides our protocol provide a reliable basis for subsequent in depth and systematic research. Our laboratory will continually explore the application of nsPEF.In terms of nerve regeneration, we will build up animal models to promote in vivo testing and evaluate the safety of nsPEF in vivo. As there is limited evidence regarding the application of nsPEF in referral nerve regeneration, we hope we can make breakthroughs.

Campos elétricos pulsados de baixa intensidade estimulam a proliferação celular De acordo com o ensaio CCK-8, a taxa de proliferação de RSC96 no grupo de 5 kV/cm foi significativamente mais rápida do que a das células do grupo controle. No entanto, à medida que os parâmetros aumentaram (20 kV/cm e 40 kV/cm), a taxa de proliferação foi instável, ainda menor do que a do grupo controle. A taxa de proliferação celular de células RSC96 no grupo 40 kV/cm foi significativamente menor do que no...

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Aqui, apresentamos um protocolo para aplicação de campo elétrico de pulso de nanossegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. A capacidade de síntese e secreção de fatores relevantes e alterações no comportamento celular validaram o sucesso da estimulação usando nsPEF. O estudo dá uma visão positiva do método de regeneração de nervos periféricos.

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse ...

Nossa pesquisa se concentra na promoção da regeneração do nervo periférico por células de cisne estimuladas por nsPEF. Esperamos desenvolver uma nova maneira de ativar os cisnes de forma eficiente, pois a regeneração nervosa é bastante difícil na maioria dos casos. Usamos de forma inovadora um nanossegundo pós-campo elétrico nsPEF para ativar células de cisne.Estamos muito satisfeitos em descobrir que o nsPEF pode ser um modo preferido para regeneração de nervos periféricos com efeitos colaterais mínimos de estimulação. Além disso, nosso protocolo fornece uma base confiável para pesquisas subsequentes e aprofundadas e sistemáticas. Nosso laboratório explorará continuamente a aplicação do nsPEF.Em termos de regeneração nervosa, construiremos modelos animais para promover testes in vivo e avaliar a segurança do nsPEF in vivo. Como há evidências limitadas sobre a aplicação de nsPEF na regeneração do nervo de referência, esperamos poder fazer avanços.

regulating-schwann-cell-growth-nanosecond-pulsed-electric-field-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro

411 visualizações.  Zhejiang University. Nossa pesquisa se concentra na promoção da regeneração do nervo periférico por células de cisne estimuladas por nsPEF. Esperamos desenvolver uma nova maneira de ativar os cisnes de forma eficiente, pois a regeneração nervosa é bastante difícil na maioria dos casos. Usamos de forma inovadora um nanossegundo pós-campo elétrico nsPEF para ativar células de cisne.Estamos muito satisfeitos em descobrir que o nsPEF pode ser um modo preferido para regeneração de nervos perifér...

Vídeo: Autor em destaque: uso inovador de nsPEF para aumentar a regeneração de nervos periféricos

Schwann cells (SCs) are myelinating cells of the peripheral nervous system, playing a crucial role in peripheral nerve regeneration. Nanosecond Pulse Electric Field (nsPEF) is an emerging method applicable in nerve electrical stimulation that has been demonstrated to be effective in stimulating cell proliferation and other biological processes. Aiming to assess whether SCs undergo significant changes under nsPEF and help explore the potential for new peripheral nerve regeneration methods, cultured RSC96 cells were subjected to nsPEF stimulation at 5 kV and 10 kV, followed by continued cultivation for 3-4 days. Subsequently, some relevant factors expressed by SCs were assessed to demonstrate the successful stimulation, including the specific marker protein, neurotrophic factor, transcription factor, and myelination regulator. The representative results showed that nsPEF significantly enhanced the proliferation and migration of SCs and the ability to synthesize relevant factors that contribute positively to the regeneration of peripheral nerves. Simultaneously, lower expression of GFAP indicated the benign prognosis of peripheral nerve injuries. All these outcomes show that nsPEF has great potential as an efficient treatment method for peripheral nerve injuries by stimulating SCs.

Here, we present a protocol for applying nanosecond pulse electric field (nsPEF) to stimulate Schwann cells in vitro. The synthesis and secretion ability of relevant factors and cell behavior changes validated the successful stimulation using nsPEF. The study gives a positive view of the peripheral nerve regeneration method.