Para começar, coloque um filtro de 70 micrômetros em um tubo de polipropileno de cinco mililitros. Pipete 500 microlitros do meio da célula neural sobre ele. Transfira o homogeneizado de tecido de hipocampo de camundongo dissociado para o tubo através do filtro.
Em seguida, pipete um mililitro de meio de células neurais frias sobre o homogeneizador duas vezes para enxaguá-lo. Agora, adicione 500 microlitros de DPBS gelado ao pellet para ressuspendê-lo. Aumente o volume da suspensão para 1,5 mililitros com DPBS.
Pipetar 500 microlitros de solução isotónica de percoll para a amostra. Cubra a solução com dois mililitros de DPBS frio na centrífuga. Em seguida, aspire a camada superior e o disco de mielina na fase intermediária.
Em seguida, adicione quatro mililitros de DPBS frio no tubo, aspire o sobrenadante após centrifugá-lo. Em seguida, ressuspenda as células em 100 microlitros de solução de coloração de viabilidade fixável. Pipetar um mililitro de DPBS frio para a amostra antes de centrifugar a amostra a 300 x g durante cinco minutos.
Depois de aspirar o sobrenadante, adicione 100 microlitros de solução de coloração CD16, CD32. Vortex a amostra por cinco segundos e depois incube. Após a incubação, adicione um mililitro de tampão FACS à amostra e centrifugue.
Pipete 100 microlitros da mistura mestre de coloração no tubo. Em seguida, incube as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Agora, adicione um mililitro de tampão FACS à amostra antes de centrifugar como antes.
Ressuspender o pellet em 250 microlitros de tampão de fixação após descartar o sobrenadante. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de permeabilização ao tubo e centrifugue novamente. Pipete 100 microlitros de solução de coloração vGLUT1 para o pellet.
Em seguida, agite a mistura por cerca de cinco segundos antes da incubação e centrifugação. Ressuspenda o pellet celular em 250 microlitros de tampão FACS. Por fim, filtrar as amostras através de um filtro de 40 micrômetros.
Um sinal fluorescente vGLUT1-PE mais alto foi observado na microglia hipocampal em comparação com o controle do isotipo. Um sinal fluorescente vGLUT1-PE mais alto foi encontrado na microglia do bulbo olfatório e um sinal mais baixo no cerebelo em comparação com o hipocampo. A menor intensidade de sinal foi detectada nos macrófagos do baço.
